LC-ESI-MS/MS-Gerät
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die systembiologischen Forschungsarbeiten am Institut für Bioverfahrenstechnik (ibvt) und dem Braunschweiger Zentrum für Systembiologie (BRICS) der TU Braunschweig verlangen die Untersuchung verschiedenster Mikroorganismen und ihrer metabolischen Antwort auf eine Vielzahl genetischer und environomischer Änderungen, um den mikrobiellen Stoffwechsel auf der Ebene der Metabolite (Metabolom) sowie der metabolischen Flüsse (Fluxom) genauer analysieren zu können und ein systemübergreifendes Verständnis der zugrundeliegenden biologischen Vorgänge zu erhalten. Zu diesem Zwecke wurde ein LC-ESI-MS/MS-Gerät beschafft. Dieses hochsensitive instrumentelle Analysengerät stellt derzeitig für die Charakterisierung und Bestimmung von Metaboliten mit Konzentrationen an der Nachweisgrenze eine zentrale Schlüsseltechnologie für die biotechnologische Prozessentwicklung dar. Das Gerät wurde insbesondere ausgewählt, um Metabolitkonzentrationen sowie Isotopomerenverteilungen in Isotopenmarkierungsstudien zur Identifizierung der Aktivitäten bekannter und potentiell neuartiger Stoffwechselwege möglichst exakt durchzuführen und damit einerseits biotechnologisch relevante Mikroorganismen im Rahmen des Metabolic Engineering gezielt zu optimieren sowie andererseits Angriffspunkte gegen pathogene Mikroorganismen aufzufinden und neue Therapieansätze zu entwickeln. Das LC-ESI-MS/MS-Gerät ermöglichte Metabolomuntersuchungen mit einer Vielzahl an biologischen Systemen, u. a. mit Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Pseudomonas putida, Rhodopseudomonas palustris sowie mit pathogenen Mikroorganismen wie Pseudomonas aeruginosa oder Yersinia pseudotuberculosis aber auch mit Pflanzenzellen. Mit B. megaterium wurden systembiologische Untersuchungen zum Metabolom und Fluxom für die Synthese von heterologen rekombinanten Proteinen durchgeführt. Weiterhin wurden innerhalb des Arbeitsgruppenschwerpunktes Pharmabioverfahrenstechnik Metabolomstudien an E. coli zur Produktion von Antitumorwirkstoffen initiiert. Im Rahmen von Arbeiten in der medizinischen Systembiologie wurden Fluxomexperimente mit Y. pseudotuberculosis durchgeführt, um bioanalytische und bioinformatische Verfahren zur Analyse infektionsrelevanter Stoffwechselprozesse zu entwickeln und zu optimieren und darauf aufbauend auf der Analyse des wirtsadaptierten bakteriellen Stoffwechsels antimikrobielle Zielstrukturen zu identifizieren, die neue Ansätze für die Therapie bakterieller Infektionen ermöglichen können. Des Weiteren wurden mit der LC-ESI-MS/MS-Technik Substrat-, Produkt- und Metabolitkonzentrationen eines trienzymatischen Systems aus Sucrose Phosphorylase/Glucose-Isomerase sowie Laminaribiose Phosphorylase, die das kostengünstige Substrat Saccharose in Laminaribiose umwandeln, bestimmt. Dazu wurde eine LC-MS-Methode entwickelt, die den Nachweis aller Komponenten des trienzymatischen Systems in einer Messung ermöglicht und die Trennung der Isomere Laminaribiose und Saccharose sowie den Nachweis höherer Oligomere, die als Nebenprodukte auftreten können, ermöglicht. Weitere Untersuchungen zur quantitative Netzwerkanalyse und zum Fluxom im zentralen Kohlenstoffmetabolismus von B. subtilis wurden durchgeführt, um durch Integration von Modellierung und experimentellen Validierungsexperimenten die Bedeutung metabolischer und regulatorischer Proteinkomplexe im zentralen Kohlen- und Stickstoffstoffwechsel von B. subtilis aufzuklären. Besonders wurden hier die physiologische Adaptationsszenarien und die biotechnologisch bedeutsamen Anpassungen an wechselnde Kohlenstoffquellen sowie osmotischen Stress untersucht. Damit konnten Grundlagen zur weiteren Optimierung biotechnologischer Anwendungen von Bacillus sp. bereitgestellt werden. Neben bakteriellen Systemen wurde das LC-ESI-MS/MS-Gerät auch für die quantitative Netzwerkanalyse und Fluxomcharakterisierung von Pflanzenzellen eingesetzt. Hier wurden innovative Methoden zur Analyse der Pflanzenphysiologie und des Metabolismus auf der Ebene des Fluxoms entwickelt, die die Analytik intrazellulärer Stoffflüsse in ganzen Pflanzen ermöglichen sollen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Microbial production of the drugs violacein and deoxyviolacein – analytical development and strain comparison. Biotechnol. Lett. 34 (2012), 717-720
Rodrigues, A. L., Göcke, Y., Bolten, C. J., Brock, N. L., Dickschat, J. S., Wittmann, C.
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Core fluxome and meta fluxome of lactic acid bacteria under cocoa pulp fermentation simulating conditions. Appl. Environ. Microb. 79 (2013), 5670-5681
Adler, P., Bolten, C. J., Dohnt, K., Hansen, C. E., Wittmann, C.
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Metabolic engineering of industrial platform microorganisms for biorefinery applications - optimization of substrate spectrum and process robustness by rational and evolutive strategies. Biores. Technol. 135 (2013), 544-554
Buschke, N., Schäfer, R., Becker, J., Wittmann, C.
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Regulatory and metabolic networks for the adaptation of Pseudomonas aeruginosa biofilms to urinary tract-like conditions. PLoS ONE 8 (2013), e71845
Tielen, P., Rosin, N., Meyer, A.-K., Dohnt, K., Haddad, I., Jänsch, L., Klein, J., Narten, M., Pommerenke, C., Scheer, M., Schobert, M., Schomburg, D., Thielen, B., Jahn, D.
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Systems metabolic engineering of Escherichia coli for production of the antitumor drugs violacein and deoxyviolacein. Metab. Eng. 20 (2013), 29-41
Rodrigues, A., Trachtmann, N., Becker, J., Blotenberg, J., Lohanatha, A., Bolten, C., Korneli, C., de Souza Lima, A., Porto, L., Sprenger, G., Wittmann, C.
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Systems metabolic engineering of xylose utilizing Corynebacterium glutamicum for production of 1,5-diaminopentane. Biotechnol. J. 8 (2013), 557-570
Buschke, N., Becker. J., Schäfer, R., Kiefer, P., Biedendieck, R., Wittmann, C.
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Adaptation of Bacillus subtilis carbon core metabolism to simultaneous nutrient limitation and osmotic challenge: a multi-omics perspective. Environ. Microbial. 16 (2014), 1898-1917
Kohlstedt, M., Sappa, P. K., Meyer, H., Maaß, S., Zaprasis, A., Hoffmann, T., Becker, J., Steil, L., Hecker, M., van Dijl, J.M., Lalk, M., Mäder, U., Stülke, J., Bremer, E., Völker, U., Wittmann, C.
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Robustness and plasticity of metabolic pathway flux among uropathogenic isolates of Pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE 9 (2014), e88368
Berger, A., Dohnt, K., Tielen, P., Jahn, D., Becker, J., Wittmann, C.
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The key to acetate: metabolic fluxes of acetic acid bacteria under cocoa pulp fermentation-simulating conditions. Appl. Environ. Microbiol. 80 (2014), 4702-4716
Adler, P., Frey, L.J., Berger, A., Bolten, C. J., Hansen, C. E., Wittmann C.
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The pyruvate-tricarboxylic acid cycle node: A focal point of virulence control in the enteric pathogen Yersinia pseudotuberculosis. J. Biol. Chem. 289 (2014), 30114-30132
Bücker, R., Heroven, A.K., Becker, J., Dersch, P., Wittmann, C.
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Comparative metabolic flux analysis of an Ashbya gossypii wild type strain and a high riboflavin-producing mutant strain. J. Biosci. Bioeng. 119 (2015), 101-106
Jeong, B. Y., Wittmann, C., Kato, T., Park, E. Y.
