Transmissions-Elektronenmikroskop für Tomographie und Kryo-TEM
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In den vergangenen Jahren wurde das Transmissions-Elektronenmikroskop für die Aufzeichnung elektronenmikroskopischer und elektronentomographischer Datensätze (TEM und STEM Modus) und für Kryo-Elektronenmikroskopie an Zellen und Einzelmolekülen eingesetzt. Die STEM-Tomographie steht mittlerweile routinemäßig zur Verfügung. Mit dieser Technologie ist es uns möglich, über den Antrag hinausgehend Präparate mit einer Schnittdicke von bis zu 1000 nm zu untersuchen. Die Auswertung der Daten erfolgt off-line, d.h. separat und zeitversetzt an dafür vorgesehenen Workstations mit Verwendung von Spezialsoftware entweder durch tomographische Rekonstruktion oder durch Einzelteilchen-Analyse, einschließlich 3D-Visualisierung. Folgende Projekte wurden bearbeitet: Konventionelle Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und TEM-Tomographie von Schlitzmembranen der Niere zur Analyse der Komplexität der Ultrastruktur der Schlitzmembran. - Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur subzellulären Lokalisation u.a. von Proteinen, die in die Biogenese der Zilienmembran involviert sind. - Elektronenmikroskopische Analyse der (fehlgeleiteten) Verteilung eines für Peroxisomen synthetisierten Proteins in Mitochondrien. - Elektronenmikroskopische Analyse zur Rolle der Endozytose bei der Ausbildung der Zilienmembran. - Elektronenmikroskopische und elektronentomographische Analyse der Nephrozyten in Drosophila melanogaster. - TEM- und STEM-Tomographie zur Untersuchung der räumlichen Verteilung von Zielproteinen in Nierengewebe, u.a. Ionenkanäle (Anoctamin), Albumin und Rezeptoren in Podozyten; Analyse der Verteilung von Ladungen in der glomerulären Basalmembran. - Räumliche Darstellung von hyperthermophilen Archaeen (Ignicoccus, Nanoarchaeum, Pyrococcus, Nitrosopumilus) mittels TEM-Tomographie von Semidünnschnitten und Serienschnitten. - Kryo-Elektronenmikroskopie zur Einzelteilchen-Analyse von Membran-Glykoprotein-Komplexen der Niere, von Vorstufen der Ribosomen-Biogenese (Hefe), von bakteriellen Membranproteinen (u.a. Solut-Transportern) sowie Ionenkanälen und Transkriptions-Regulatoren in Archaeen. Für diese Zwecke musste und wird das Gerät laufend eingestellt, justiert und für die anstehenden Messverfahren optimiert. Dies schloss in den vergangenen Jahren mit ein: Einrichten und Optimieren des TEM und der die Bilder aufzeichnenden CMOS-Kamera für verschiedene Anwendungen, u.a. TEM-Tomographie, Elektronenbeugung, und Kryo-Elektronenmikroskopie unter Niederdosis-Bedingungen. - Einrichten des Gerätes und des Steuer-Rechners für TEM-Tomographie: dies beinhaltet die Installation, das Testen und die kontinuierliche Weiterentwicklung von zwei Softwarepaketen für die Ansteuerung des Gerätes, vollautomatische Einstellung der Präparathöhe und -stelle, Fokussierung unter Niederdosis- Bedingungen und Aufzeichnung des Datensatzes. - Einrichten des Gerätes für Kryo-Elektronenmikroskopie einschließlich Testen von zwei Softwarepaketen für die vollautomatische Abrasterung des Präparates unter Niederdosis-Bedingungen, Einstellung geeigneter Abbildungsbedingungen für das Wiederfinden von Präparatstellen (Tracking), Fokussieren unter Low-dose-Bedingungen, und Erstellen von Aufnahmeserien. - Erstmaliges Einrichten und Umprogrammieren eines 200 kV Transmissions-Elektronenmikroskops für STEM-Tomographie mit paralleler Beleuchtung an bis zu 1 µm dicken Schnitten, einschließlich Einstellung spezieller Linsenströme, sowie der Mit-Entwicklung einer geeigneten Software am Steuer-Rechner, einschließlich Autofokus für STEM sowie automatischer, paralleler Aufzeichnung von Hellfeldund Dunkelfeld-STEM-Bildern.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2013) Photochemically Active Fluorophore-DNA/RNA Conjugates for Cellular Imaging of Nucleic Acids by Readout in Electron Microscopy. ChemistryOpen 2: 136-140
Holzhauser C, Kracher S, Rubner MM, Schmucker W, Wagenknecht HA, Witzgall R
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(2014) Mistargeting of peroxisomal EHHADH and inherited renal Fanconi's syndrome. N Engl J Med 370: 129-138
Klootwijk ED, Reichold M, Helip-Wooley A, Tolaymat A, Broeker C, Robinette SL, Reinders J, Peindl D, Renner K, Eberhart K, Assmann N, Oefner PJ, Dettmer K, Sterner C, Schroeder J, Zorger N, Witzgall R, Reinhold SW, Stanescu HC, Bockenhauer D, Jaureguiberry G, Courtneidge H, Hall AM, Wijeyesekera AD, Holmes E, Nicholson JK, O'Brien K, Bernardini I, Krasnewich DM, Arcos- Burgos M, Izumi Y, Nonoguchi H, Jia Y, Reddy JK, Ilyas M, Unwin RJ, Gahl WA, Warth R, Kleta R
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(2014) The calcium-activated chloride channel Anoctamin 1 contributes to the regulation of renal function. Kidney Int. 85: 1369-1381
Faria D, Rock JR, Romao AM, Schweda F, Bandulik S, Witzgall R, Schlatter E, Heitzmann D, Pavenstädt H, Herrmann E, Kunzelmann K, Schreiber R
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(2015) Advanced electron microscopic techniques provide a deeper insight into the peculiar features of podocytes. Am J Physiol Renal Physiol 309: F1082-F1089
Burghardt T, Hochapfel F, Salecker B, Meese C, Gröne HJ, Rachel R, Wanner G, Krahn MP, Witzgall R
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(2015) Integration of Cistromic and Transcriptomic Analyses Identifies Nphs2, Mafb, and Magi2 as Wilms' Tumor 1 Target Genes in Podocyte Differentiation and Maintenance. J Am Soc Nephrol 26: 2118-2128
Dong L, Pietsch S, Tan Z, Perner B, Sierig R, Kruspe D, Groth M, Witzgall R, Gröne HJ, Platzer M, Englert C
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(2016) Intravital imaging reveals Angiotensin II-induced transcytosis of albumin by podocytes. J Am Soc Nephrol 27: 731-744
Schießl IM, Hammer A, Kattler V, Gess B, Theilig F, Witzgall R, Castrop H
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(2017) Molecular Insights into lipid-assisted Ca2+ regulation of the TRP channel Polycystin-2. Nat Struct Mol Biol 24: 123-130
Wilkes M, Madej MG, Kreuter L, Rhinow D, Heinz V, de Sanctis S, Ruppel S, Richter S, Joos F, Grieben M, Pike S, Huiskonen JT, Carpenter EP, Kühlbrandt W, Witzgall R, Ziegler C
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(2017) Natriuretic Peptide Receptor Guanylyl Cyclase-A in Podocytes is Renoprotective but Dispensable for Physiologic Renal Function. J Am Soc Nephrol 28: 260-277
Staffel J, Valletta D, Federlein A, Ehm K, Volkmann R, Füchsl AM, Witzgall R, Kuhn M, Schweda F
