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Vielfarben-Durchflusszytometer

Fachliche Zuordnung Mikrobiologie, Virologie und Immunologie
Förderung Förderung in 2011
Projektkennung Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 194827213
 
Erstellungsjahr 2016

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Das Vielfarb-Durchflusszytometer wurde für eine Reihe von laufenden Forschungsprojekten und Publikationen eingesetzt. Des Weiteren ist dieses Gerät auch essentiell für neue Forschungsanträge, die entweder geplant bzw. schon eingereicht wurden. Im Rahmen eines Antrags bei der Deutschen Krebshilfe wurde ein Protokoll für die Produktion von dendritischen Zellen, welche für die Therapie von Tumorpatienten eingesetzt werden, optimiert. Dafür wurden insbesondere FastDC, die nach Differenzierung von peripheren Blutmonozyten mit klinischen Goldstandard oder zwei alternativen Differenzierungs-Cocktails in Kombination mit IFN und Liganden für verschiedene Toll-like Rezeptoren erhalten wurden, durchflusszytometrisch bezüglich ihrer Differenzierungs- und Aktivierungsmarker charakterisiert. Parallel dazu wurde das mRNA-Expressionprofil der verschiedenen Fast DC-Populationen und unreifen DC als Kontrolle mittels cDNA-Arrays charakterisiert und nachfolgend funktionelle Analysen, wie Sekretion von Zytokinen, Induktion von zytotoxischer Aktivität nach Kokultur mit Lymphozyten durchgeführt. Nach der Induktion der Differenzierung wird die Expression verschiedener Marker (kostimulatorische Moleküle, wie z. B. CD40, CD80, CD86 und CD83) in Kombination mit MHC-Klasse-I- und Klasse-II-Molekülen analysiert und dadurch der Phänotyp der verschiedenen DC-Populationen detailliert charakterisiert. Parallel wird auch die von insbesondere von polarisierenden Zytokinen, wie IL-12, Typ 1-Interferone und IL-2 nachgewiesen. In Bezug auf Untersuchungen zum „immune escape“ von Tumoren wurden in Melanom- und Mammakarzinomzelllinien sowie in Onkogen-transformierten Zellkulturmodellen die Expression klassischer und nicht-klassischer HLA-Antigene sowie deren APM-Komponenten untersucht. Dabei wurden durchflusszytometrisch nicht nur die HLA-Klasse-I-Oberflächenexpression, sondern auch die Expression verschiedener Komponenten der MHC-Klasse-I-Antigenprozessierungsmaschinerie (APM) intrazellulär bestimmt. Parallel wurde die Proliferationsrate gemessen sowie Zellzyklusanalysen durchgeführt und diese mit der Expression von MHC-Klasse-I-Antigenen korreliert. In einem weiteren Schritt wurden Melanom- und Mammakarzinomzelllinien mit Immunzellen kokultiviert und nach CFSE-Markierung durchflusszytometrisch die Immunzellproliferation bestimmt, intrazellulär die Expression von Zytokinen in den Immunzellen nachgewiesen und des Weiteren ein CD107-Degranulationsassay durchgeführt. In einem weiteren von der Deutschen Krebshilfe (Mildred Scheel) geförderten Projekt, welches sich mit der IFN-γ Signaltransduktion und der MHC-Klasse-I-Prozessierung befasst, wurden durchflusszytometrisch die verschiedenen Signaltransduktionskomponenten (unphosphoryliert vs. phosphoryliert) in Kombination mit APM-Komponenten in den Tumorzellen bestimmt. Nach Ko- Kultivierung der Tumorzellen mit Immunzellen wurden insbesondere die verschiedenen T-Zellsubpopulationen charakterisiert. Ebenfalls wird der Effekt der verschiedenen Signalwege (z.B. PI3K, MAPK) auf die Expression von MHC Klasse I APM-Komponenten untersucht, wobei Komponenten der verschiedenen Signalwege (unphosphoryliert vs. phosphoryliert) durchflusszytometrisch analysiert. In einem über das GRK-1591 finanzierte Projekt wurden verschiedene microRNAs, die an die 3‘-UTR von PDL-1 binden, identifiziert und die Rolle dieser miRNAs auf die T-Zellantwort bestimmt. Dafür wurden nach Transfektion von Mimics die miRNA-Expression herunterreguliert und die T-Zellerkennung von mock-transfizierten vs. Mimics-transfizierten Zellen verglichen. Des Weiteren wird die Generierung Tumorantigen-spezifischer T-Zellsubpopulationen analysiert, wobei parallel naive Effektor- und Effektor-Gedächtniszellen unter Verwendung der entsprechenden Marker charakterisiert werden. Parallel dazu wurde auch die Expression ko-stimulatorischer sowie koinhibitorischer Rezeptoren auf den T-Zellen nachgewiesen. Die simultane Analyse der Zytokinproduktion, des Effektorstatus sowie verschiedener apoptotischer Prozesse wird mittels Propidium-Jodid-Markierung, Annexin-V, Nachweis aktiver Caspasen und Tunel-Assay von Tumor- und Immunzellen aus der Tumor-T-Zell-Kokultur durchgeführt. Es wurde auch der Einfluss von Tyrosinkinase- und Checkpoint-Inhibitoren auf die Immunzellantwort überprüft. Dafür werden Immunzellen von gesunden Spendern und Tumorpatienten vor und nach Behandlung mit Tyrosinkinase-Inhibitoren bzw. immunmodulatorischen Molekülen, wie anti-PD1- und anti-CTLA4-Antikörpern, bestimmt. Die Zytokinprofile (IFN-γ, TNF-α, IL-2 und MIB1-β) werden mittels Durchflusszytometrie und intrazellulärer Färbung erstellt. Parallel werden auch Membranrezeptoren, d. h. andere Immunmediatoren, wie CD107 (Degranulation) und CXCR-3 (Wanderung) gemessen. Ebenfalls werden die T-Zell-Proliferationskapazität mittels CFSE und die Antigen-Spezifität mittels Tetramer-Färbung, die Zytokin-Sekretion, der Granzym-B-Gehalt der T-Zellpopulationen und die T-Zell-Polyfunktionalität überprüft. Neben der Immunphänotypisierung von Lymphozyten wird auch die Frequenz von regulatorischen T-Zellen sowie immunsuppressiven myeloiden Suppressorzellen bestimmt. Dafür werden die Zellen mit den anti-CD3, anti-CD4, anti-CD25, anti- CD45RO, anti-GITR und anti-CD39 Antikörpern inkubiert. Diese Multicolor-Färbungen ermöglichen die Identifizierung verschiedener T-Zellpopulationen, die CD3+, CD4+, CD25high und/oder FoxP3 exprimieren. Ebenfalls werden die verschiedenen Treg- und MDSC-Populationen nach TKI-Behandlung untersucht, da TKIs zu einem Zusammenbruch des immunsuppressiven Tumormikromilieus führen. Außerdem wird die Expression von CXR3 von CD8+ T-Zellen aus dem Blut analysiert.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

 
 

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