Ti:Saphir-Festkörperlasersystem für 2-Photonenmikroskopie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Lasersystem wurde unmittelbar nach seiner Auslieferung in das bestehende 2-Photonen Laser-Scanning System integriert. Parallel wurde ein kommerzieller Scankopf mit umfangreicher Analyse- und Steuerungssoftware beschafft und weitere Systemkomponenten optimiert. Ferner wurden ein FLIM-Detektor zur zuverlässigen Bestimmung der Fluoreszenzlebenszeiten, ein optionaler multifokaler Scanner zur nachhaltigen Steigerung der Abtastrate und Lichtausbeute, sowie ein softwaregesteuerter XY-Tisch zum automatisierten Scannen größerer Präparate integriert. Diese umfangreichen Optimierungen und Weiterentwicklungen lieferten ein äußerst vielseitig einsetzbares 2-Photonen Laser-Scanning System. Bisherige Forschungsschwerpunkte umfassten die Entwicklung und Etablierung von Assays zur detaillierten Analyse der Mitochondrienfunktion, ihrer subzellulären Heterogenität und ihrer Interaktion mit anderen Organellen. Analysen des mitochondrialen Membranpotentials (∆ψm) mit dem emissionsratiometrischen Indikator JC-1 offenbarten spontane ∆ψm Änderungen in kultivierten hippokampalen Astrozyten der Ratte, die vom endoplasmatischen Retikulum initiiert werden und offenbar zur Aktivitäts-Metabolismus Koppelung beitragen. Funktionelle Einschränkung der Mitochondrien und daraus resultierender oxidativer Stress wurden in einem Mausmodell des Rett Syndroms nachgewiesen. In kultivierten hippokampalen Astrozyten dieser Mäuse konnten mittels JC-1 zwar keine Veränderungen des ∆ψm oder der Mitochondrienmorphologie, aber eine kompensatorisch erhöhte Mitochondrienanzahl gezeigt werden. Die Etablierung genetisch-kodierter Redox Sensoren bewies zudem in hippokampalen Zell- und Slicekulturen, dass in Neuronen und Gliazellen dieser Mäuse die Redox-Balance gestört ist und dass die mitochondriale Matrix sowie das Zytosol einer erhöhten oxidativen Belastung ausgesetzt sind. Um zukünftig die Redox-Sensoren auch für quantitative Analysen in adulten und intakten Geweben einsetzen zu können, wurden bereits ihre FLIM-Antworten unter 2-Photonenanregung kalibriert und ihre Eignung für exzitations-ratiometrisches 2-Photonen-Imaging verifiziert. Basierend auf diesen umfangreichen (sub)zellulären Analysen wurde der zuverlässigste Redox-Sensor identifiziert und transgene Mausmodelle generiert. Diese Tiere exprimieren nun neuronenspezifisch den GFP-basierten Redox-Indikator im Zytosol oder der mitochondrialen Matrix. Das detaillierte zerebrale Verteilungsmuster des Redox-Indikators wird derzeit mittels 2-Photonen Imaging kartiert, und durch funktionelle Kalibrierungstests ergänzt. Diese Redox-Indikator Mäuse werden es ermöglichen, zelluläre Redoxveränderungen in neurologischen Krankheitsbildern, wie z.B. dem Rett Syndrom, mit dem Auftreten erster Symptome und ihrer Progression zu korrelieren.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2011). Ratiometric high resolution imaging of JC-1 fluorescence reveals the subcellular heterogeneity of astrocytic mitochondria. Pflüg. Arch. Eur. J. Physiol. 462: 693-708
Keil V., Funke F., Zeug A., Schild D., Müller M.
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(2012). Oxidative burden and mitochondrial dysfunction in a mouse model of Rett syndrome. Neurobiol. Dis. 48: 102-114
Großer E., Hirt U., Janc O.A., Menzfeld C., Fischer M., Kempkes B., Vogelgesang S., Manzke T.U., Opitz L., Salinas-Riester G., Müller M.
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(2013). Emission ratiometric multiphoton imaging of JC-1 fluorescence reveals mitochondrial alterations in a mouse model of Rett syndrome. Proceedings of the 10th Göttingen Meeting of the German Neuroscience Society T10-2C
Müller M., Bebensee D.
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(2014) Response properties of the genetically encoded optical H2O2 sensor HyPer. Free Rad. Biol. Med. 76: 227-241
Weller J., Kizina K.M., Can K., Bao G., Müller M.
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(2014). Aberrant redox homeostasis in Rett syndrome affects cytosol and mitochondria. Society for Neuroscience Abstracts, 515.17
Can K., Tolö J., Kügler S., Müller M.
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(2014). Advanced ROS/redox imaging based on genetically-encoded probes, ratiometric 2-photon microscopy and fluorescence-lifetime imaging. Acta Physiologica, Supplement s695: 203-204
Müller M., Kizina K., Bao G.
