Ti:Saphir-Festkörperlasersystem für 2-Photonenmikroskopie
Final Report Abstract
Das Lasersystem wurde unmittelbar nach seiner Auslieferung in das bestehende 2-Photonen Laser-Scanning System integriert. Parallel wurde ein kommerzieller Scankopf mit umfangreicher Analyse- und Steuerungssoftware beschafft und weitere Systemkomponenten optimiert. Ferner wurden ein FLIM-Detektor zur zuverlässigen Bestimmung der Fluoreszenzlebenszeiten, ein optionaler multifokaler Scanner zur nachhaltigen Steigerung der Abtastrate und Lichtausbeute, sowie ein softwaregesteuerter XY-Tisch zum automatisierten Scannen größerer Präparate integriert. Diese umfangreichen Optimierungen und Weiterentwicklungen lieferten ein äußerst vielseitig einsetzbares 2-Photonen Laser-Scanning System. Bisherige Forschungsschwerpunkte umfassten die Entwicklung und Etablierung von Assays zur detaillierten Analyse der Mitochondrienfunktion, ihrer subzellulären Heterogenität und ihrer Interaktion mit anderen Organellen. Analysen des mitochondrialen Membranpotentials (∆ψm) mit dem emissionsratiometrischen Indikator JC-1 offenbarten spontane ∆ψm Änderungen in kultivierten hippokampalen Astrozyten der Ratte, die vom endoplasmatischen Retikulum initiiert werden und offenbar zur Aktivitäts-Metabolismus Koppelung beitragen. Funktionelle Einschränkung der Mitochondrien und daraus resultierender oxidativer Stress wurden in einem Mausmodell des Rett Syndroms nachgewiesen. In kultivierten hippokampalen Astrozyten dieser Mäuse konnten mittels JC-1 zwar keine Veränderungen des ∆ψm oder der Mitochondrienmorphologie, aber eine kompensatorisch erhöhte Mitochondrienanzahl gezeigt werden. Die Etablierung genetisch-kodierter Redox Sensoren bewies zudem in hippokampalen Zell- und Slicekulturen, dass in Neuronen und Gliazellen dieser Mäuse die Redox-Balance gestört ist und dass die mitochondriale Matrix sowie das Zytosol einer erhöhten oxidativen Belastung ausgesetzt sind. Um zukünftig die Redox-Sensoren auch für quantitative Analysen in adulten und intakten Geweben einsetzen zu können, wurden bereits ihre FLIM-Antworten unter 2-Photonenanregung kalibriert und ihre Eignung für exzitations-ratiometrisches 2-Photonen-Imaging verifiziert. Basierend auf diesen umfangreichen (sub)zellulären Analysen wurde der zuverlässigste Redox-Sensor identifiziert und transgene Mausmodelle generiert. Diese Tiere exprimieren nun neuronenspezifisch den GFP-basierten Redox-Indikator im Zytosol oder der mitochondrialen Matrix. Das detaillierte zerebrale Verteilungsmuster des Redox-Indikators wird derzeit mittels 2-Photonen Imaging kartiert, und durch funktionelle Kalibrierungstests ergänzt. Diese Redox-Indikator Mäuse werden es ermöglichen, zelluläre Redoxveränderungen in neurologischen Krankheitsbildern, wie z.B. dem Rett Syndrom, mit dem Auftreten erster Symptome und ihrer Progression zu korrelieren.
Publications
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