Regulation von peroxisomalen Metabolit-Transportproteinen

• Antragstellerin: Professorin Dr. Nicole Linka
• Fachliche Zuordnung: Pflanzenphysiologie
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 196842819

Die Aufrechterhaltung des Redox-Status ist für das Überleben von Zellen wichtig, da Änderungen schwerwiegende Folgen für zahlreiche zelluläre Funktionen haben. Im vorherigen Antrag haben wir einen peroxisomalen Transporter in Arabidopsis charakterisiert. Dieser versorgt peroxisomale Redox-Reaktionen mit NAD und ist ein guter Regulator für die peroxisomale Redox-Homeostasis. Wir konnten weiterhin zeigen, dass der NAD-Transporter durch reversible Phosphorylierung reguliert wird. Eine solche post-translationale Modifikation ermöglicht eine schnelle Anpassung der Proteinfunktion an interne Signale und wechselnden Umweltbedingungen. Unser Folgeantrag möchte zum Verständnis beitragen wie der peroxisomale Redox-Status kontrolliert wird. Dazu adressieren wir die folgenden Fragen: (1) Welche Auswirkung hat die Phosphorylierung des NAD-Transportproteins auf die Funktionen der Peroxisomen in vivo? Um diesen Aspekt zu untersuchen, werden Arabidopsis- und Hefe-Mutanten, die mit NAD unterversorgt sind, mit dem phosphorylierten bzw. nicht-phosphorylierten NAD-Carrier komplementiert. Die phänotypischen Analysen der Mutanten geben Rückschlüsse darauf, inwiefern der Phosphorylierungsstatus einen Einfluss auf peroxisomale Funktionen im lebenden Organismus hat. (2) Welcher Anteil an phosphoryliertem zu nicht-phosphoryliertem NAD-Carrier führt zu einer Änderung der Gesamt-Proteinaktivität und damit zu einem Effekt der peroxisomalen Funktion? Die Phosphorylierungsdynamik des NAD-Carriers wird mit Hilfe eines quantitativen massenspektrometrischen Ansatz unter der Verwendung von stabilen Isotopen untersucht. Dazu werden wir Arabidopsis-Keimlinge verwenden, da sie einen hohen NAD+-Bedarf für die Speicherlipid-Mobilisierung in den Peroxisomen aufweisen. Diese Studie liefert Informationen, die für ein mathematisches Modell zur Beschreibung eines regulatorischen Netzwerks der Zelle genutzt werden können. (3) Welche Proteinkinase ist für die Regulation des NAD-Transportproteins verantwortlich? Dazu planen wir eine Kombination von chemischem Cross-Linking und Massenspektrometrie. Zunächst wird die Kinase an das PXN-Protein kovalent verknüpft. Mit Hilfe eines Standard-Pull-down wird der Protein-Kinase-Komplex aus dem Arabidopsis-Extrakt isoliert. Die durch Protein-Sequenzierung identifizierte Kinase wird schließlich anhand von in vitro und in vivo Kinase-Experimente für das NAD-Protein bestätigt.Das Langzeit-Ziel unserer Arbeitsgruppe zu verstehen, wie die Peroxisomen in dem zellulären Stoffwechsel integriert sind. Dabei spielen peroxisomale Transportproteine eine große Rolle, da sie Peroxisomen mit anderen Zell-Kompartimenten über den Austausch von gelösten Stoffen miteinander verbinden. Dieser Antrag trägt dazu bei, unser limitiertes Wissen zu erweitern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen