Proteinexpression im murinen Zellkulturmodell der Filaminopathie und Charakterisierung einer neuen, humanen Filamin C-Mutation
Molekulare und zelluläre Neurologie und Neuropathologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Mutationen im Filamin C-Gen (FLNC) verursachen erbliche Muskelerkrankungen (Filaminopathien), die zu einer fortschreitenden Muskelschwäche bis hin zum Verlust der Gehfähigkeit führen und die Lebenserwartung deutlich reduzieren können. Die kontraktilen Einheiten der Muskelfasern sind die Myofibrillen. Für deren Entwicklung und Erhalt ist das Protein Filamin C essentiell. Die in diesem Projekt untersuchten FLNC-Mutationen bewirken sogenannte myofibrilläre Myopathien (MFM). Diese sind dadurch gekennzeichnet, dass sich einerseits Myofibrillen an bestimmten Stellen auflösen und sich andererseits mutiertes Filamin C sowie zahlreiche weitere Proteine in Form von Aggregaten in den Muskelfasern ablagern. Ziele unseres Projektes waren die eingehende klinische und funktionelle Charakterisierung einer neuen FLNC-Mutation sowie eine weitergehende Aufschlüsselung der Zusammensetzung von krankhaften Proteinablagerungen bei MFM- Filaminopathien. Die klinischen Untersuchungen bei Patienten mit der neu entdeckten FLNC-Mutation ergaben, im Gegensatz zu anderen MFM-Formen, ein einheitliches Muster. Die Erkrankung führte im Durchschnitt ab dem 37. Lebensjahr zu einer fortschreitenden Muskelschwäche, die zunächst die Beinmuskulatur betraf und sich im Verlauf auf die Armmuskulatur, die Rumpfmuskulatur und die Atemmuskulatur ausbreitete. Der Verlust der Gehfähigkeit setzte 15-20 Jahre nach dem Auftreten erster Beschwerden ein. Zudem fand sich bei einigen Patienten eine Herzbeteiligung. Bei anderen MFM-verursachenden FLNC-Mutationen zeigte sich ein ähnliches Bild, die Erkrankung manifestierte sich hier im Durschnitt jedoch etwa 6 Jahre später. Kernspintomographische Untersuchungen der Beinmuskulatur ergaben eine für die MFM-Filaminopathie typische und spezifische Verteilung von fettigen Muskelveränderungen. Dies unterstreicht den Stellenwert dieser Untersuchung bei der differentialdiagnostischen Abklärung von Muskelerkrankungen. Im Gegensatz dazu zeigten die mikroskopischen Untersuchungen zwar MFM-typische Veränderungen, diese waren jedoch nicht spezifisch für die MFM-Filaminopathie. Biochemische und biophysikalische Analysen ergaben Hinweise darauf, dass die neu entdeckte FLNC- Mutation zu einer Instabilität des von den Muskelfasern produzierten Proteins führt. Zudem wird die normalerweise stattfindende paarweise Zusammenlagerung von Filamin C-Proteinen (Dimerisierung) gestört. Dies hatten wir bereits vermutet, da die Mutation in dem Bereich von Filamin C liegt, der für die Dimerisierung essentiell ist (Dimerisierungsdomäne). Interessanterweise konnten wir jedoch keine Ablagerungen von mutierten Filamin C-Proteinen in Form von Aggregaten beobachten. Das ist insofern überraschend, weil wir diesen Effekt bei einer anderen FLNC-Mutation, die ebenfalls in der Dimerisierungsdomäne liegt, nachweisen konnten. Die Initiierung der Aggregatbildung scheint daher komplexer zu sein, als zunächst angenommen. Denkbare relevante Faktoren wären z.B. eine gestörte Interaktion von Filamin C mit anderen Proteinen oder ein negativer Einfluss auf den geregelten Abbau von Proteinen. Nach Einbringung des mutierten Gens in Maus-Muskelzellen, die im Labor gezüchtet wurden, bildeten auch diese die MFM-typischen Proteinaggregate. Diese Zellmodelle werden derzeit für erste Testungen von neuen Therapieansätzen eingesetzt. Zur Entschlüsselung der Zusammensetzung der Proteinaggregate wurden Muskelproben von MFM- Patienten mit unterschiedlichen FLNC-Mutationen im Rahmen von Proteomanalysen untersucht. Hierfür wurden zunächst die wenige 1000stel Millimeter großen Aggregate mit einem Laser ausgeschnitten und anschließend mit einem Massenspektrometer analysiert. Durch Vergleich mit Kontrollproben konnten insgesamt 88 Proteine identifiziert werden, die sich in den Aggregaten anreichern und somit krankheitsrelevant sind. Den mengenmäßig größten Anteil machten Proteine aus, die in einem bestimmten Bereich der Myofibrillen (den sogenannten Z-Scheiben) lokalisiert sind. Darüber hinaus konnten wir zahlreiche Proteine detektieren, die bei der Qualitätskontrolle und beim Abbau von Proteinen eine Rolle spielen. Hieraus ergeben sich neue Ansatzpunkte für Theorien zur Krankheitsentstehung sowie für Therapiestrategien, die in laufenden und geplanten Folgeprojekten auf ihre Gültigkeit bzw. Wirksamkeit hin überprüft werden sollen. Wir haben zum Beispiel, ausgehend von den Ergebnissen der Proteomanalysen, bereits einen neuen Bindungspartner von Filamin C entdeckt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Pathophysiology of protein aggregation and extended phenotyping in filaminopathy. Brain. 2012 Sep;135(Pt 9):2642-60
Kley RA, Serdaroglu-Oflazer P, Leber Y, Odgerel Z, van der Ven PF, Olivé M, Ferrer I, Onipe A, Mihaylov M, Bilbao JM, Lee HS, Höhfeld J, Djinovic-Carugo K, Kong K, Tegenthoff M, Peters SA, Stenzel W, Vorgerd M, Goldfarb LG, Fürst DO
(Siehe online unter https://doi.org/10.1093/brain/aws200) - A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Mol Cell Proteomics. 2013 Jan;12(1):215-27
Kley RA, Maerkens A, Leber Y, Theis V, Schreiner A, van der Ven PFM, Uszkoreit J, Stephan C, Eulitz S, Euler N, Kirschner J, Müller K, Meyer HE, Tegenthoff M, Fürst DO, Vorgerd M, Müller T, Marcus K
(Siehe online unter https://doi.org/10.1074/mcp.M112.023176) - Differential proteomic analysis of abnormal intramyoplasmic aggregates in desminopathy. J Proteomics. 2013 Sep 2;90:14-27
Maerkens A, Kley RA, Olivé M, Theis V, van der Ven PFM, Reimann J, Milting H, Schreiner A, Uszkoreit J, Eisenacher M, Barkovits K, Güttsches AK, Tonillo J, Kuhlmann K, Meyer HE, Schröder R, Tegenthoff M, Fürst DO, Müller T, Goldfarb LG, Vorgerd M, Marcus K
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.jprot.2013.04.026) - Filamin C-related myopathies: pathology and mechanisms. Acta Neuropathol. 2013 Jan;125(1):33-46
Fürst DO, Goldfarb LG, Kley RA, Vorgerd M, Olivé M, van der Ven PF
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00401-012-1054-9) - Impairment of protein degradation in myofibrillar myopathy caused by FLNC/filamin C mutations. Autophagy. 2013 Mar 1;9(3):422-3
Kley RA, van der Ven PF, Olivé M, Höhfeld J, Goldfarb LG, Fürst DO, Vorgerd M
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.4161/auto.22921) - Myofibrillar myopathies: new developments. Curr Opin Neurol. 2013 Oct;26(5):527-535
Olivé M, Kley RA, Goldfarb LG
(Siehe online unter https://doi.org/10.1097/WCO.0b013e328364d6b1)
