Interaktion zwischen Osteoblasten und Endothelzellen: Untersuchungen zur posttranskriptionellen Regulation der osteoblastären Expression der alkalischen Phosphatase (ALP) und des Platelet-derived growth factor receptor (PDGF-R) alpha
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Neovaskularisation spielt eine wichtige Rolle bei der Knochenneubildung im Rahmen des Tissue Engineerings von Knochengewebe. Um die Vaskularisation beim Tissue Engineering von Knochengewebe zu fördern verfolgen wir seit einigen Jahren die Strategie der Koimplantation humaner Osteoblasten (hOBs) und humaner Endothelzellen (ECs). Hierbei bewirken die implantierten hOBs die Regeneration von Knochengewebe, während die implantierten ECs in der Lage sind stabile funktionsfähige Blutgefäße auszubilden. Die interzelluläre Kommunikation zwischen ECs und hOBs ist von großer Bedeutung, sowohl für die Osteogenese, als auch für die Homöostase des Endothels. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass die direkte Kokultivierung von ECs und hOBs zu einer Stimulierung der Expression des osteoblastären Differenzierungsmarkers alkalische Phosphatase (ALP) und zu einer Inhibierung der osteoblastären Expression des Platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) alpha führt. In diesem Projekt wurden die molekularen Mechanismen der Genexpressionsveränderungen von ALP und PDGFR-α untersucht. Wir konnten hierbei feststellen, dass beide Gene in hOBs über einen post-transkriptionellen Mechanismus gesteuert werden. Die Kokultivierung mit ECs bewirkt hierbei eine Stabilisierung der ALP mRNA, während die PDGFR-α mRNA destabilisiert wird. Beide mRNAs werden intrazellulär über den p38-MAPK-Weg reguliert und sind unabhängig von einer interzellulären Kommunikation über GAP-Junctions. Mit Hilfe von pull-down Experimenten mit biotinylierter RNA aus dem 3´-nicht-translatierten Bereich der ALP mRNA und Nanoflow-HPLC Massenspektrometrie konnten wir Vimentin als RNA-bindendes Protein nachweisen, welches die ALP mRNA stabilisiert. Im Gegensatz zu ALP wurde die PDGFR-α Expression über microRNAs reguliert. Durch ein microRNA-Profiling konnten wir zeigen, dass miR-126 in hOBs nach Kokultivierung mit ECs hochreguliert wird und miR-126 ein indirekter negativer Regulator der PDGFR-α Expression ist. Darüber hinaus führte die Überexpression von miR-126, wie auch die pharmakologische Inhibierung des PDGFR-α zu einer Inhibierung der Migration von hOBs, was den Schluss nahe legt, dass das miR-126/PDGFR-α System eine wichtige Rolle spielt bei der Regulation der Migration von hOBs. In weiterführenden Experimenten haben wir auch untersucht, welche Genexpressionsveränderungen in ECs induziert werden nach Kokultivierung mit hOBs. Hierzu wurde ein Microarray Genexpressionsprofil der ECs nach Monokultur, direkter Kokultur und indirekter Kokultur mit hOBs erstellt. Durch Metacore-Analysen konnten wir nach direkter Kokultivierung mit hOBs eine markante Hochregulation von Transkripten feststellen, die assoziiert sind mit den Begriffen extrazelluläre Matrix, Zell-Matrix Interaktion und Angiogenesefaktoren. Herunterregulierte Transkripte hingegen waren predominant assoziiert mit Zellzyklus-verwandten Prozessen. Weitere Analysen ergaben das die Kokultivierung der hOBs mit ECs zu einer Steigerung der Proliferation der hOBs, nicht jedoch der ECs führt und gleichfalls die Apoptoserate der Osteoblasten über Phosphorylierung und damit Inhibierung des pro-apoptotischen Proteins BAD erniedrigt wird, während die Apoptoserate der ECs nicht verändert wird. Schließlich wurden im Rahmen dieses DFG-Projektes auch noch Experimente durchgeführt, die gezeigt haben, dass der PDGFR-Signalweg von Bedeutung ist für die Serum- oder PDGF-BB-induzierte Proliferation von Osteoprogenitorzellen, aber der PDGFR keine Rolle spielt bei der osteogenen Differenzierung dieser Zellen. Die im Rahmen dieses DFG-Projektes gewonnenen Erkenntnisse tragen nachhaltig zum Verständnis der komplexen Interaktionen zwischen Endothelzellen und Osteoblasten bei.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2009). Up-regulation of alkaline phosphatase expression in human primary osteoblasts by co-cultivation with primary endothelial cells is mediated by p38 MAPK-dependent mRNA stabilization. Tissue Engineering Part A, 15, 3437-3447
Hager, S., Lampert, F. M., Orimo, H., Stark, G. B. and Finkenzeller, G.
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(2010). Heterotypic Cell-Contacts between Human Endothelial Cells and Human Osteoprogenitor-Cells Support Osteogenic Differentiation. Plastic & Reconstructive Surgery, 126(2S), 717
Lampert, F., Finkenzeller, G and Stark, G.B.
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(2010). Platelet-derived growth factor receptor signaling is not involved in osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Tissue Engineering Part A, 16, 983-993
Kumar, A., Salimath, B. P., Stark, G. B. and Finkenzeller, G.
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(2010). Post-transcriptional regulation of osteoblastic platelet-derived growth factor receptor-alpha expression by cocultured primary endothelial cells. Cells Tissues Organs, 192, 28-38
Finkenzeller, G., Mehlhorn, A.T., Schmal, H. and Stark, G.B.
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(2012). Auswirkungen von humanen Endothelzellen auf das Proliferationsverhalten und das Überleben von mesenchymalen Stammzellen und primären humanen Osteoblasten. Jahrestagung der DGPRÄC (Deutsche Gesellschaft für Plastische, Rekonstruktive und Ästhetische Chirurgie), Bremen, 13-15. 09.2012
Lampert, F., Steiner, D., Stark, G.B., Finkenzeller, G.
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(2012). Effects of endothelial cells on proliferation and survival of human mesenchymal stem cells and primary osteoblasts. Journal of Orthopaedic Research, 30, 1682-1689
Steiner, D., Lampert, F., Stark, G.B. and Finkenzeller, G.
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(2012). Effects of endothelial cells on proliferation and survival of human primary osteoblasts. 4th European Plastic Surgery Research Council, Hamburg, 23-26.08.2012
Steiner, D., Lampert, F., Stark, G.B., Finkenzeller,G.
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(2013). Bindung der osteoblastären mRNA der alkalischen Phosphatase an Intermediärfilamente – Implikationen für Tissue Engineering des Knochens. Jahrestagung der DGPRÄC (Deutsche Gesellschaft für Plastische, Rekonstruktive und Ästhetische Chirurgie), Münster, 12 -14. 09. 2013
Simunovic, F.,Schmidt, Y., Biniossek, M., Stark, GB., Finkenzeller, G.
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(2013). Die Rolle der miR-126 in der Funktion der Osteoblasten. Jahrestagung der DGPRÄC (Deutsche Gesellschaft für Plastische, Rekonstruktive und Ästhetische Chirurgie), Münster, 12 -14. 09. 2013
Schmidt, Y., Simunovic, F., Finkenzeller, G., Stark, GB., Pfeifer, D.
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(2013). In vitro Studie zur Evaluation der Effekte von humanen primären Endothelzellen auf die Proliferation und Apoptose primärer Osteoblasten und mesenchymaler Stammzellen. Jahrestagung der DGPRÄC (Deutsche Gesellschaft für Plastische, Rekonstruktive und Ästhetische Chirurgie), Münster, 12 -14. 09. 2013
Finkenzeller, G., Steiner, D., Lampert, F., Stark, GB.
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(2013). Increased extracellular matrix and proangiogenic factor transcription in endothelial cells after cocultivation with primary human osteoblasts. Journal of Cellular Biochemistry, 114, 1584-1594
Simunovic, F., Steiner, D., Pfeifer, D., Stark, G.B., Finkenzeller, G. and Lampert, F.
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(2013). Transcription of extracellular matrix components and proangiogenic factors is increased in endothelial cells after cocultivation with primary human osteoblasts 2013 (5th European Plastic Surgery Research Council (EPSRC), Hamburg, 22.-25.08.2013)
Steiner D, Lampert F, Simunovic F, Pfeifer D, Stark GB, Finkenzeller G
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(2014). miR-126 regulates platelet-derived growth factor receptor-α expression and migration of primary human osteoblasts. Biological Chemistry, 396,1, S. 61-70
Schmidt, Y., Simunovic, F., Strassburg, S., Pfeifer, D., Stark, G.B. and Finkenzeller, G.
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(2015). Osteoblastic alkaline phosphatase mRNA is stabilized by binding to Vimentin intermediary filaments. Biological Chemistry, Band 396, Heft 3, S. 253–260
Schmidt, Y., Biniossek, M., Stark, G.B., Finkenzeller, G. and Simunovic, F.
