Regulation und Enzymologie apoptotischer Nukleasen
Final Report Abstract
Unspezifische Nukleasen kommen ubiquitär in allen Reichen des Lebens vor, wo sie extrazellulär (oft sezerniert) nutritive (Serratia marcescens, Anabaena sp.) oder defensive (Streptococcus pneumoniae) Funktionen haben, oder intrazellulär, wo sie regulatorische Aufgaben im weitesten Sinne wahrnehmen. Wir haben im Rahmen eines DFG‐Projekts extrazelluläre bakterielle Nukleasen untersucht, deren katalytischen Mechanismus aufgeklärt und uns maßgeblich an ihrer Strukturaufklärung beteiligt. Eines dieser Enzyme (Serratia Nuklease) haben wir für ihre Anwendung beim Downstream‐Processing von rekombinanten Proteinen optimiert. Ein anderes Enzym (Streptococcus pneumoniae Nuklease EndA), spielt als Pathogenitätsfaktor eine große Rolle, weil es die angeborene Immunabwehr ausschaltet. Auf Grund unserer strukturellen und mechanistischen Untersuchungen ergibt sich die Perspektive, niedermolekulare Inhibitoren zu entwickeln, um EndA zu inaktivieren und damit Streptokokken‐Infektionen zurückzudrängen. In einem weiteren DFG‐Projekt haben wie uns mit apoptotischen Nukleasen, insbes. mit der Caspase aktivierten DNase (CAD) und der Nuklease EndoG befasst. Im Vordergrund unseres Interesses stand die Frage nach dem Katalysemechanismus und der Regulation dieser Nukleasen. Während die Katalysemechanismen bei beiden Enzymen sehr ähnlich sind (die beiden Enzyme gehören der Serratia Nuklease Familie an), kommen zwei unterschiedliche Strategien bei der Regulation zum Einsatz. CAD wird durch einen spezifischen Inhibitor gehemmt, der auch als Faltungshelfer fungiert und die Translokation in den Kern unterstützt, EndoG liegt im Intermembranraum des Mitochondriums kompartimentiert vor. Beide Nukleasen werden erst im Zuge der Apoptose freigesetzt, aus dem Komplex mit dem Inhibitor (CAD) bzw. aus dem mitochondrialen Kompartiment (EndoG). Unerwartet und erfreulich für uns war, dass sich herausstellte, dass CAD zu der Familie der ββα‐Me‐Finger Nukleasen (Serratia Nuklease Familie) gehört, die wir bereits seit 1990 ausgiebig untersucht und deren Katalysemechanismus wir aufgeklärt hatten. Überraschend für uns war, dass der CAD‐ICAD‐Komplex mit Chromatin assoziiert ist und dort im Zuge der Apoptose aktiviert wird. Erfreulich war ebenso die Identifizierung und erstmalige molekulare Charakterisierung einer zur Endonuklease G paralogen Exonuklease (EXOG), die vermutlich an der mitochondrialen DNA‐ Reparatur beteiligt ist. Bemerkenswert war, dass man eine durch Aminosäureaustausch inaktivierte Nuklease (EndA His160 → Ala) durch Supplementierung des Puffers in vitro bzw. des Mediums in vivo mit Imidazol reaktivieren kann.
Publications
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