Live Cell Imaging Fluoreszenzmikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Technische Verwendung: Generell wurden Fluoreszenzuntersuchungen in lebenden Zellen (S. cerevisiae und humane Zelllinien) mittels GFP o.ä. (live cell Imaging), sowie in fixierten Zellen mittels Immunfluoreszenz durchgeführt. Außerdem wurden in situ-Hybridisierungen mit RNA-Sonden durchgeführt. Zur Datenverarbeitung wurden Dekonvolutionsanalysen durchgeführt und Videos aufgenommen aber auch Einzelbilder verwendet. Des Weiteren wurden Quantifizierungen durchgeführt und Markierungen vorgenommen. U.a. wurden die folgenden Forschungsthemen wurden untersucht: 1. Nukleozytoplasmatischer Transport der Telomerase RNA TLC1. Telomerase beschützen das Ende linerarer Chomosomen davor in jeder Replikationsrunde verkürzt zu werden. Die Telomerase besteht aus verschiedenen Proteinen und einer RNA (TLC1 in S. cerevisiae). TLC1 wird vom Zellkern ins Zytoplasma transportiert wo die RNA schließlich an die Est- Proteine bindet. Die gereifte Telomerase wird dann wieder in den Zellkern transportiert wo sie ihre Aufgabe an den Telomeren nachgeht. In unserem Forschungsprojekt konnten wir zeigen, dass der Export von TLC1 nicht nur von dem RanGTPase-abhängigen Exportfaktor Crm1/Xpo1 abhängt, sondern auch von mRNA Exportfaktoren. In Mutanten von Mex67 und Dbp5 akkumuliert TLC1 im Zellkern. Da nur wenig TLC1 RNAs in einer Zelle vorhanden sind, ist die Visualisierung nicht einfach. Mittels des Fluoreszensmikroskops und der sehr guten Kamera ist es uns jedoch gelungen die RNA- Moleküle gut sichtbar zu machen (sowohl mittels live cell imaging als auch durch in situ Hybridisierungen). Die mikroskopischen Daten wurden durch biochemische Interaktionsstudien untermauert die gezeigt haben dass Mex67 und Dbp5 an TLC1 binden. Schließlich ist es uns auch gelungen zu zeigen, dass der mRNA-Exportweg (Mex67) mit dem Protein-Exportweg (Crm1/Xpo1) zusammenarbeitet um TLC1 ins Zytoplasma zu transportieren, denn in Doppelmutanten wird die Reifung der Telomerase verhindert was in vivo zu einer Verkürzung der Telomerenden führt. 2. Qualitätskontrolle von gespleißten mRNAs durch die RNA-bindenden Serin/Arginin (SR)- reichen Proteine Gbp2 und Hrb1. Eukaryontische Zellen müssen verhindern, dass ungespleißte RNA in der Zytoplsasma gelangt, denn dort findet die Translation aller mRNAs statt. Intron enthaltende RNAs würden nicht korrekt in die codierten Proteine übersetzt werden was zu Defekten in den Zellen und in multizellulären Organismen zu Krankheiten wie Krebs und neurodegenerativen Krankheiten führt. In unseren Arbeiten konnten wir zeigen dass Gbp2 und Hrb1 notwendig für die Qualitätskontrolle gespleißter Transkripte ist. In ihrer Abwesenheit gelangen vermehrt ungespleißte RNAs in das Zytoplasma. Dies wurde mit Fluoreszenzaufnahmen von poly(A)+RNAs und einzelnen RNAs mittels in situ Hybridisierung gezeigt. Diese Beobachtungen wurden durch Zellfraktionierungsexperimente und biochemische Interaktionsstudien untermauert. Weitergehende Studien haben gezeigt, dass die beiden SR-Proteine die RNA-Abbaumaschinerie (TRAMP-Komplex und nukeäres Exosom) an falsche RNAs rekrutieren, an korrekt gespleißte mRNAs aber den mRNA Exportrezeptor Mex67. Auf diese Weise wird die mRNA Prozessierung durch Gbp2 und Hrb1 überwacht und der Export kontrolliert und reglementiert. 3+4. Das SR-Protein Npl3 ist notwendig für den Transport und die reibungslose Bildung des Ribosoms im Zytoplasma durch Interaktion der kleinen und großen Untereinheit. Unsere Forschungsarbeiten haben gezeigt dass Npl3 am Transport der großen ribosomalen Untereinheit vom Zellkern in das Zytoplasma erforderlich ist. Das konnten wir mit biochemischen und genetischen Experimenten zeigen, aber auch mit mikroskopischen Untersuchungen. Zum Einen haben wir den Export von GFP-getaggten ribosomalen Untereinheiten analysiert, zum anderen haben wir aber auch einen neuen Assay etabliert in dem wir in situ Hybridisierungen mit rRNA-Sonden durchgeführt haben. Diese Studien wurden dann fortgeführt und wir konnten zeigen, dass Npl3 genetisch und physikalisch mit so genannten „ribosomal subunit joining factors“ interagiert. Diese Faktoren sind wichtig für die Bildung des Monosoms, das entscheidend ist für einen reibungslosen Ablauf der Translation. Die Ribosomenformationsdefekte in npl3∆ sind auch in Ribosomalen Profilen erkennbar und erhärten somit unsere Entdeckung dass Npl3 bei der Ribosomenbildung wichtig ist.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2011) The mRNA export factor Npl3 mediates the nuclear export of large ribosomal subunits. EMBO Rep. 12: 1-7
Hackmann A, Gross T, Baierlein C, Krebber H
- (2013) Monosome formation during translation initiation requires the serine/arginine-rich protein Npl3. Mol Cell Biol. 33: 1-12
Baierlein C, Hackmann A, Gross T, Henker L, Hinz F, Krebber H
- (2014) Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells. Nat Cell Biol. 8: 1-12
Ertych N, Stolz A, Stenzinger A, Weichert W, Kaulfuß S, Burfeind P, Aigner A, Wordeman L, Bastians H
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/ncb2994) - (2014) Quality control of spliced mRNAs requires the shuttling SR proteins Gbp2 and Hrb1. Nat Commun. 5: 1-14
Hackmann A, Wu H, Schneider UM, Meyer K, Jung K, Krebber H
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/ncomms4123) - (2014) Telomerase RNA TLC1 shuttling to the cytoplasm requires mRNA export factors and is important for telomere maintenance. Cell Rep. 8:1-9
Wu H, Becker D, Krebber H
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.celrep.2014.08.021)
