Binding and conformational changes of VWF under shear

• Antragsteller: Professor Dr. Joachim Rädler
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 172540668

Das Multimer von Willebrand Faktor (VWF) spielt in der Blutgerinnung als mechanosensitives Protein eine bedeutende Rolle. Bei verletzungen fördert er sowohl die Bindung von Plättchen an Kollagen als auch die Plättchenaggregation, wodurch sich filamentöse Netzwerke ausbilden, die das verletze Endothelgewebe bedecken. Dabei sind die meisten Funktionen des VWF scherabhängig, da einige VWF Domänen eine Struktur besitzen, die unter Scherspannung entfalten kann. Neben der Multimergröße ist daher die Domänenstruktur entscheidend für die scherabhängige Funktionalität des VWFs. Dennoch gibt es viele Polymorphismen, deren Konsequenzen für die Gesundheit bislang unbekannt sind. Die Quantifizierung molekularer Affinitäten des VWF Wildtyps und seiner Mutanten könnte, insbesondere unter Scherfluss und in Blutplasma, diese Lücke füllen. In der ersten Förderperiode haben wir gezeigt, dass sich Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) hervorragend für VWF-Messungen in Blutplasma eignet und die Sensitivität aufweist auch krankheitsrelevante VWF Mutanten zu charakterisieren. Wir haben zeigen können, dass die Größenverteilung des rekombinanten plasmatischen eGFP-VWF exponentiell verteilt ist, was wir auf ein schrittweises Wachstum in der Polymerisierung während der Biosynthese zurückführen. Desweiteren haben wir einen neuartigen Ansatz entwickelt, der, basierend auf FCS in Kombination mit einer selbstgebauten Scherzelle, die Kinetik der VWF Spaltung durch ADAMTS13 quantifiziert. Mit Bindungsstudien der Proteindisulfidisomerase (PDI) an VWF und Mutanten mittels FCS und mikroskaliger Thermophorese (MST) haben wir zudem gezeigt, dass PDI die Dimerisierung des VWF unterstützt. Für die kommende Förderperiode beabsichtigen wir, VWF Bindungsstudien unter Scherfluss durchzuführen mit Fokus auf dynamischen Struktur-Funktions-Beziehungen, sowohl des Wildtyps als auch der VWF Mutanten. Insbesondere interessieren wir uns für die Interaktionen, die der kollektiven Netzwerkbildung zugrundeliegen: intermolekulare VWF Vernetzung und Bindung an GPIIb/IIIa, in Abhängigkeit von Polymorphismen der C4 Domäne. Zusätzlich werden wir vollständige Bindungsisotherme der VWF Bindung an biomimetischen, Endothelzellen-ähnlichen Vesikeln messen und Bindung an Kollagen Typ III und VI von VWF mit Mutationen in der A1 und A3 Domäne. Dafür werden wir die zwei quantitative Techniken FCS und MST verwenden. Eine besondere technische Herausforderung ist die Bestimmung von Bindungsaffinitäten unter Scherfluss, die wir durch Zweifarben-Kreuzkorrelation mit Hilfe eines gepulsten (PIE-FCS) Aufbaus lösen wollen. Dabei werden wir die Auswirkung des C4 Polymorphismus auf Öffnung und Bindungsverhalten des VWF Stammes untersuchen. Die Strukturuntersuchungen sollen durch Kleinwinkel-Röntgenstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie ergänzt werden. Schließlich werden wir unsere Studien des enzymatischen VWF Verdaus auf pathophysiologische Bedingungen erweitern, wie sie z.B. in Entzündungsherden auftreten.

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 1543: Shear flow regulation of hemostasis - Bridging the gap between nanomechanics and clinical presentation
• Großgeräte: Microscopy setup for TCSPC
• Gerätegruppe: 5080 Optisches Mikroskopzubehör