Molekulare Mechanismen der Modulation von Virus-Erkennung durch die RNA-Helikase Lgp2
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die zellautonome Erkennung von Pathogenen durch das angeborene Immunsystem höherer Organismen basiert auf dem Prinzip der Mustererkennung. Viren werden im Zytoplasma von Zellen anhand von konservierten Strukturen ihrer Nukleinsäuren erkannt. Die Proteine, die durch Bindung typischer viraler Nukleinsäurestrukturen anti-virale Genprogramme auslösen, gehören zur Klasse der Mustererkennungsrezeptoren. Es hat sich gezeigt, dass in Säugern die Familie der RIG-I-like-RNA-Helikasen (RLHs) für die Erkennung viraler RNA wichtig ist. Die Proteine RIG-I und MDA-5 dieser Familie lösen nach Bindung ihrer jeweiligen RNA- Liganden anti-virale Signaltransduktion aus, während das dritte Protein LGP2 als Modulator der durch RIG-I und MDA-5 ausgelösten Signaltransduktion beschrieben ist. Virale genomische RNA, DI-Genome und auch Replikations-Intermediate, die als Liganden für RIG-I und MDA5 vermutet werden, liegen physiologischerweise in Zellen nicht als nackte Nukleinsäureketten vor, sondern werden noch während des Prozesses der Replikation dicht in virale Proteine verpackt und liegen sowohl im Viruspartikel als auch im Zytoplasma als Ribonukleoproteinpartikel (RNP) vor. Dabei wird vermutet, dass die Bindung der viralen Proteine die Bindung der RNA an RIG-I und MDA5 be- oder verhindert. Aus den publizierten Daten der Analyse von LGP2-defizienten Mäusen und aus eigenen Untersuchungen wurde daher die Hypothese abgeleitet, dass virale Ribonukleoprotein (RNP)-Partikel von LGP2 erkannt und strukturell so modifiziert werden, dass die Erkennung durch MDA5 und RIG-I erleichtert wird. In unserem Forschungsprojekt konnten wir Evidenz für diese Hypothese erbringen. Wir konnten in humanen Zelllinien in knock-down und knock-out Ansätzen zeigen, dass LGP2 als positiver Kofaktor upstream von RIG-I und MDA-5 wirkt und Stimulus-abhängig mit RIG-I und MDA-5 interagiert. In in vitro Experimenten mit rekombinant-hergestellten Proteinen und synthetischen Liganden konnten wir zeigen, dass LGP2 im Gegensatz zu MDA5 und RIG-I eine basale ATP Hydrolyserate besitzt – RIG-I und MDA5 dafür in Anwesenheit eines Liganden zu einer höheren maximalen Hydrolyserate aktiviert werden als LGP2. Dabei ist für die Aktivierung der ATPase Aktivität von MDA5 lange dsRNA von 100-150 bp ohne 5’ Modifikation notwendig ist, während die ATPase Aktivität von LGP2 bereits durch kurze dsRNA ausgelöst wird. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass LGP2 in Anwesenheit von doppelsträngiger RNA seine Konformation ändert und hochmolekulare Oligomere bildet. Nach Etablierung eines Protokolls zur Aufreinigung intakter RNPs aus dem vesicular stomatitis Virus (VSV) konnten wir zeigen, dass RNPs tatsächlich an LGP2 binden, dadurch eine Konformationsänderung auslösen und die ATPase Aktivität von LGP2 triggern. Diese Daten passen zur aufgestellten Hypothese. Ein tatsächlicher strukturell-mechanistischer Nachweis ihrer Richtigkeit steht jedoch noch aus. Die RLHs sind als Rezeptorfamilie zellbiologisch interessant, sie erkennen aber auch klinisch bedeutsame Viren, wie die Hepatitis-Viren, das Tollwut-Virus oder Influenza-A-Viren und spielen durch die Erkennung endogener Nukleinsäuren eine Rolle in Autoimmunerkrankungen (Singleton-Merten Syndrom, Aicardi Goutieres Syndrom, Typ I Diabetes). LGP2 als wesentlicher Modulator der Erkennung von Viren und endogener RNA durch MDA5 und RIG-I ist ein potentielles Target für eine pharmakologische Beeinflussung sowohl in viralen Infektionen als auch in RLH-assoziierten Autoimmunerkrankungen. Vorraussetzung, um dieses Potential nutzbar zumachen, ist ein genaues funktionelles Verständnis, zu dem das hier beschriebene Projekt ein Stück weit beiträgt. Es fehlen aber weiterhin noch wesentliche Details, um die Funktion von LGP2 korrekt beschreiben zu können.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2012). Sensing of viral nucleic acids by RIG-I: from translocation to translation. Eur J Cell Biol 91, 78-85
Schmidt, A., Rothenfusser, S., and Hopfner, K.P.
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(2014). Isolation of RIG-I-associated RNAs from virus-infected cells. Methods Mol Biol 1169, 37-44
Schmidt, A., Linder, A., Linder, N., and Rothenfusser, S.
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Modulation of virus recognition by the innate RNA receptor LGP-2, Jahrestagung der deutschen Gesellschaft für Immunologie, September 2014, Bonn
Raps J., Gradel M., Rädler J., Pandey D., Schmidt A., Rothenfusser S .
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(2015). Polymorphisms in melanoma differentiation-associated gene 5 link protein function to clearance of hepatitis C virus. Hepatology 61, 460-470
Hoffmann, F.S., Schmidt, A., Dittmann Chevillotte, M., Wisskirchen, C., Hellmuth, J., Willms, S., Gilmore, R.H., Glas, J., Folwaczny, M., Muller, T., Berg, T., Spengler, U., Fitzmaurice, K., Kelleher, D., Reisch, N., Rice, C.M., Endres, S., and Rothenfusser, S.
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(2015). The E3 Ubiquitin Ligase TRIM9 Is a Filopodia Off Switch Required for Netrin-Dependent Axon Guidance. Developmental cell 35, 698-712
Menon, S., Boyer, N.P., Winkle, C.C., McClain, L.M., Hanlin, C.C., Pandey, D., Rothenfusser, S., Taylor, A.M., and Gupton, S.L.
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(2017). Th17 micro-milieu regulates NLRP1-dependent caspase-5 activity in skin autoinflammation. PLoS One 12, e0175153
Zwicker, S., Hattinger, E., Bureik, D., Batycka-Baran, A., Schmidt, A., Gerber, P.A., Rothenfusser, S., Gilliet, M., Ruzicka, T., and Wolf, R.
