Elektroaktive Proteinmultischichtarchitekturen - Untersuchungen zum Elektronentransfer und Anwendungen in der Bioanalytik
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ausgehend von bereits etablierten Cytochrom c Multischichten auf Basis von Polyelektrolyten bzw. Nanopartikeln wurden neuartige Proteinarchitekturen auf Elektroden aufgebaut. Ein Ansatz beschäftigte sich mit der Herstellung von Cytochrom c Mutanten und ihrem Einsatz in Multischichtassemblaten. Hierbei wurde das elektrochemische Verhalten sowohl in einer Monoschicht als auch in multiplen Schichten auf Elektroden charakterisiert und mit dem Selbstaustausch der Mutanten in Lösung korreliert (NMR Messungen). Der Austausch von geladenen Lysinen durch ungeladenes Alanin war hierbei der Hauptansatz. In Abhängigkeit von der Mutationsstelle konnten eindeutig Änderungen in der Selbstaustauschrate nachgewiesen werden. Dabei war das Verhalten in Lösung mit dem auf der Elektrode korrelierbar. In diesem Teil des Projektes wurde auch untersucht, ob ein Elektronentransfer innerhalb von Cyt c Kristallen möglich ist. Es konnten Calixaren-unterstützte Kristalle auf Thiolmodifiziertem Gold präpariert werden und Bedingungen gefunden werden, die eine stabile Untersuchung der Kristalle ermöglichte. Trotzdem nur ein kleiner Teil der Elektrodenfläche mit Kristallen besetzt war, konnten sehr deutliche Cyt c Redoxsignale erhalten werden. Dies deutet auf einen Elektronentransport durch den Kristall hin. Das kinetische Verhalten ähnelt dem einer Cyt c Multischicht-Elektrode. Interessant ist, dass hier trotz des Verlustes an Rotationsbeweglichkeit (im Vergleich zu Multischichtassemblaten) offensichtlich ein Elektronentransport zwischen den Hämzentren möglich ist. Dies kann für bestimmte Raumrichtungen mit dem relativ geringen Hämabstand (2,37nm) erklärt werden. Aufgrund der Verkürzung der Projektlaufzeit konnte der Ansatz der Nutzung anderer kleiner Redoxproteine für den Aufbau von multiplen Schichtarchitekturen nicht bearbeitet werden. Ein dritter Arbeitsschwerpunkt beschäftigte sich mit der Integration von Enzymen in Multischichtarchitekturen. Hierbei wurde zum einen ein Enzym genutzt, das mit Cyt c reagiert - Fruktosedehydrogenase. Hierbei wurde ein besonderer Fokus auf die Untersuchung des pH Verhaltens gelegt. Für Cyt c wurden zwei pH Optima gefunden – im Gegensatz zum Elektronenakzeptor der im Standardtestverfahren eingesetzt wird. Es gelang das Enzym auch in multiple Schichten von Cyt c unter Nutzung von dsDNA einzubetten und damit eine Fruktose-sensitive Elektrode aufzubauen. Hier kann gezeigt werden, dass das Verhältnis von Cyt c:FDH großen Einfluss auf die Größe des katalytischen Stromes hat. Ebenfalls lässt dieser sich durch die Anzahl der aufgebrachten Schichten steigern. Außerdem gelang es zwei Enzyme simultan in ein Schichtsystem zu integrieren – Laccase und Cellobiosedehydrogenase. Die Anwesenheit des jeweiligen Enzyms stört dabei nicht die Arbeit des anderen. Die Aktivität der beiden Enzyme kann über den Redoxzustand von Cyt c und damit über das Elektrodenpotential kontrolliert werden. So können auch Laccase bzw. CDH-Moleküle in weiter entfernten Schichten von der Elektrode angesprochen werden. Der Elektronenselbstaustausch zwischen den Cyt c Molekülen sorgt hier für einen Elektronentransfer der so effektiv ist, dass er die Signalkette ausgehend vom Enzymsubstrat (hier Sauerstoff bzw Lactose) nicht limitiert. Beide Substrate können mit dieser Elektrode analysiert werden. Die im Projekt gemachten Untersuchungen belegen die Bedeutung des Elektronenselbstaustausches von Cyt c als Basis für die Arbeit von multiplen Schichten des Redoxproteins auf Elektroden. Außerdem konnte dieser Selbstaustausch mit Enzymreaktionen von Cyt c kombiniert und für den Aufbau neuer Proteinarchitekturen genutzt werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- “Nanobiomolecular multiprotein clusters on electrodes for formation of a switchable cascadic reaction scheme”, Angewandte Chemie International Edition 53 (22) (2014) 5676-5679
S. C. Feifel, A. Kapp, R. Ludwig, F. Lisdat
(Siehe online unter https://doi.org/10.1002/anie.201310437) - “Protein Multilayer Architectures on Electrodes for Analyte Detection”; in Biosensor Based on Aptamers and Enzymes, Series: Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, Vol. 140, 253-298, Springer (2014)
S. C. Feifel, A. Kapp, F. Lisdat
- "Microscale Crystals of Cytochrome c and Calixarene on Electrodes: Interprotein Electron Transfer between Defined Sites", Angewandte Chemie International Edition 54 (21) (2015) 6356-6359
R. E. McGovern, S. C. Feifel, F. Lisdat, P. B. Crowley
(Siehe online unter https://doi.org/10.1002/anie.201500191) - “Insights into interprotein electron transfer of human cytochrome c variants arranged in multilayer architectures by means of an artificial silica nanoparticle matrix”, ACS Omega, 2016, 1 (6), pp 1058–1066
S.C. Feifel, K. Stieger, A. Kapp, D. Weber, M. Allegrozzi, M. Piccioli, P. Turano, F. Lisdat
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acsomega.6b00213) - „Interaction of Flavin Dependent Fructose Dehydrogenase with the Redoxprotein Cytochrome c as Basis for the Construction of Biomacromolecular Architectures on Electrodes”, Analytical Chemistry 88 (2016) 6382-6389
C. Wettstein, D. Schäfer, K. Kano, U. Wollenberger, F. Lisdat
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6b00815)
