LOV Domain Signaling
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Fast alle Organismen besitzen Lichtsensoren, mit denen sie ihre Reaktionen auf unterschiedliche Lichtverhältnisse steuern. Drei von den bisher bekannten sechs Photorezeptorfamilien nutzen als Chromophor ein Flavin, das für blaues (λ < 460 nm) Licht empfindlich ist. Unter diesen haben die LOV-Domänen (light-oxygen-voltage) insofern eine Sonderstellung, als ihre primäre Photoreaktion über den Triplettzustand des Flavins (als FMN) erfolgt und daher vergleichsweise langsam ist. Diese Reaktion führt vom „Dunkelzustand“ zum „Signalzustand“, in dem eine kovalente Bindung zwischen C4a des FMN und dem Schwefelatom eines benachbarten Cysteins gebildet wird. In allen anderen flavinbasierten Photorezeptoren und den meisten anderen Flavoproteinen reagiert Flavin als Elektronenakzeptor, es wird also zum Radikalanion (FMN*-) oder, nach Protonierung, zum Neutralradikal FMNH* reduziert. Als erstes Teilprojekt wurde untersucht, in wie weit eine lichtinduzierte Redoxreaktion auch in LOV-Domänen eine Rolle spielt. Dies wurde schon mehrfach als erster Schritt der Adduktbildung postuliert, d.h., dass diese durch einen Elektronentransfer vom Schwefel zum FMN eingeleitet wird. In den letzten Jahren wurden zwar gelegentlich geringe Mengen an radikalischen Flavinspezies in LOV-Domänen nachgewiesen, allerdings gab es bisher keinen schlüssigen Beweis, dass diese tatsächlich Intermediate im Photozyklus sind. Bei der Suche nach Elektronen-Transfer-Wegen im LOV Protein wurde eine Mutante (LOV1-F41Y) gefunden, in der Elektronentransfer so schnell und effizient verläuft, dass die eigentliche Adduktbildung unterdrückt wird, obwohl das reaktive Cystein noch vorhanden ist. Dies war bisher noch in keinem LOV-Protein beobachtet worden. Die detaillierte Untersuchung dieser sowie verwandter Mutanten macht es wahrscheinlich, dass Elektronentransfer tatsächlich auch im Wildtyp stattfindet, das entstehende Radikal aber schneller weiterreagiert als es gebildet wird. In einem zweiten Teilprojekt wurde eine LOV-Variante gefunden, die einen effizienten Elektronentransfer (hier allerdings ohne das reaktive Cystein) ausführt, wobei ein langlebiges Radikal gebildet wird, was sogar gegen Luftsauerstoff stabil ist. Dieses sogenannte iLOV-Q489D ist daher als Tool für optogenetische Studien von Interesse. Nach der Adduktbildung muss aus der chemisch gespeicherten Information ein biologisches Signal werden. Da viele LOV-Domänen als Dimere vorkommen, lag die Hypothese nahe, dass Dimerisierung bzw. Dissoziation von Dimeren ein Teil dieser Signalkaskaden ist. Um dies zu studieren, wurden LOV-Domänen mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert und dann der Förster-Energietransfer (FRET) zwischen diesen Farbstoffen beobachtet. An der LOV Domäne von Rhodobacter sphaeroides (RsLOV) konnte gezeigt werden, dass die im Dunkeln vorliegenden Dimere in einem dynamischen Gleichgewicht mit den Monomeren stehen, wobei der Austausch auf einer Zeitskala von ca. 1 Sekunde erfolgt. Um Einblick in die Signalweiterleitung im Dunkeln zu gewinnen, wurden Computersimulationen mit der MD-Methode durchgeführt. Es wurden sowohl die Monomeren und Dimeren von RsLOV untersucht, als auch das Konstrukt Rac1-LOV2, mit dem die biologische Funktion des Rac1-Proteins photoschaltbar gemacht werden soll.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Electron transfer pathways in a light, oxygen, voltage (LOV) protein devoid of the photoactive cysteine, Scientific Reports, 2017, 7, 13346:1-16
Benita Kopka, Kathrin Magerl, Anton Savitsky, Mehdi D. Davari, Katrin Röllen, Marco Bocola, Bernhard Dick, Ulrich Schwaneberg, Karl- Erich Jaeger, und Ulrich Krauss
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Switching from adduct formation to electron transfer in a light–oxygen–voltage domain containing the reactive cysteine, Phys. Chem. Chem. Phys. 2017, 19, 10808 – 10819
Kathrin Magerl, Ivan Stambolic und Bernhard Dick
