Komparative und explorative genetische und metabolische Analysen zu den Anforderungen an eine zellfreie Kultivierung der pflanzenpathogenen Phytoplasmen

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professorin Dr. Carmen Büttner; Professor Dr. Michael Kube
• Fachliche Zuordnung: Pflanzenzüchtung, Pflanzenpathologie
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2015
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 204307631

• Erstellungsjahr: 2015

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Im vorliegenden Projekt wurden in komparativen Analysen im Vorfeld und während des Projektes publizierte Genome und Draftsequenzen sowie im Projekt generierte Daten mit dem Schwerpunkt metabolische Rekonstruktion analysiert und die Ergebnisse als Grundlage zum angestrebten Erreichen einer Kultivierung der Phytoplasmen in zellfreien Medien genutzt. Es wurden zunächst die vorliegenden Daten zu den Phytoplasmen analysiert und das gemeinsame genetische Repertoire bestimmt. Im Projektverlauf wurden neue Publikationen anderer Arbeitsgruppen in die Analysen eingebunden und ergänzt. Hierzu gehören die Analyse der vollständigen Genome von Acholeplasma palmae und A. brassiceae, sowie der Draftsequenzen von Stämmen aus 'Candidatus Phytoplasma solani' und 'Ca. P. cynodontis'. Diese Datensätze ermöglichten zusammen mit den Ergebnissen aus weiteren Kooperationen eine weitgehende komparative Analyse und die Chance, die Daten um A. oculi zu erweitern und Parallelen in der Evolution zwischen Phyto- und Achoplasmen zu charakterisieren. Neben der funktionalen in silico Rekonstruktion wurden Transkriptomdaten herangezogen, aber auch die Genexpression von selektierten Genen untersucht. Die so gewonnenen Ergebnisse zum Metabolismus wurden in Experimenten zur Kultivierung von Phytoplasmen verwendet. Die Analysen zeigen einen hochkonservierten gemeinsamen Phytoplasma-Genset auf, der weitgehend auch in den Acholeplasmen kodiert wird. Unterschiede im genetischen Repertoire zwischen den Gattungen schließen den Metabolismus sowie die an der Pathogen-Wirt-Interaktion beteiligten Membran- und Effektorproteinen ein. Lediglich vierzehn Phytoplasma-spezifische Proteine liegen in den Phytoplasmen gemeinsam vor, aber nicht in den Acholeplasmen. Der Verlust von Genen zur Kodierung des FoF1-ATPase sowie des Chaperons GroEL ist dabei kein Alleinstellungsmerkmal der Phytoplasmen in den Acholeplasmataceae. Weiterhin konnte am Beispiel von 'Ca. P. mali' die Expression von Stoffwechselgenen des zentralen Metabolismuses analysiert werden. In diesen Analysen gelang es auch zum ersten Mal ein SAP11-ähnliches Effektor-Protein in 'Ca. P. mali' zu identifizieren. Die Datensätze wurden außerdem wiederholt zur phylogenetischen Analyse der Phytoplasmen bis zu den Gram-positiven Vorläufern unter Verwendung der 16S-rRNA und von Proteinen des Metabolismuses genutzt. Der Teilverlust der Glykolyse in einigen Phytoplasmen ist vermutlich durch den Bedeutungsverlust als ursprünglicher zentraler Energie-liefernder Stoffwechselweg zu interpretieren, dessen wichtigste Bedeutung vermutlich in der Bereitstellung von Intermediaten für den Lipidstoffwechsel darstellt. Einmalig in den Mollicutes ist die Aufnahme und der erstmalig vollständig rekonstruierte Katabolismus von Carbonsäuren in den Phytoplasmen. Ein kürzlich durch eine andere Arbeitsgruppe veröffentlichtes Verfahren zur Kultivierung von Phytoplasmen (Contaldo et al. 2012) konnte in Übereinstimmung mit den Ergebnissen anderer AGs nicht reproduziert werden. Auf der Basis der eigenen Resultate wurden Experimente zur Phytoplasma-Kultivierung mittels Supplementierung von Mycoplasma-Medien mit den zuvor bestimmten Metaboliten durchgeführt. Im Rahmen des Förderungszeitraumes konnte keine Kultur etabliert werden. Die im Projekt erzielten und in zahlreichen Fachpublikationen dokumentierten Arbeitsergebnisse haben maßgeblich zum heutigen Wissensstand über die Acholeplasmataceae beigetragen und geben bedeutende Einblicke in die Pathogen-Wirt Interaktion und insbesondere die metabolischen Vorgänge. Die Erkenntnisse zum Metabolismus und den damit verbundenen Ansprüchen der Phytoplasmen an ein artifizielles Medium ermöglichen eine zielgerichtete Weiterführung der Experimente.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• Current view on phytoplasma genomes and encoded metabolism. ScientificWorldJournal. 2012; 2012:185942
  Kube M, Mitrovic J, Duduk B, Rabus R, Seemüller E
  
• The AAA+ ATPases and HflB/FtsH proteases of 'Candidatus Phytoplasma mali': phylogenetic diversity, membrane topology, and relationship to strain virulence. Mol Plant Microbe Interact. 2013 Mar;26(3):367-76
  Seemüller E, Sule S, Kube M, Jelkmann W, Schneider B
  
• "Complete genomes and deduced metabolism of acholeplasmas in comparison to members of 'Candidatus Phytoplasma'." In: Phytoplasmas and phytoplasma disease management: how to reduce their economic impact. Ed. A. Bertaccini. Bologna, Italy: IPWG - International Phytoplasmologist Working Group, 2014. 263-71
  Kube M, Siewert C, Migdoll AM, Duduk B, Mitrovic J, Holz S, Rabus R, Reinhardt R, Seemüller E, Büttner C
  
• Analysis of expressed genes of the bacterium 'Candidatus Phytoplasma mali' highlights key features of virulence and metabolism. PLoS One. 2014 Apr 11;9(4):e94391
  Siewert C, Luge T, Duduk B, Seemüller E, Büttner C, Sauer S, Kube M
  
• Analysis of the complete genomes of Acholeplasma brassicae, A. palmae and A. laidlawii and their comparison to the obligate parasites from 'Candidatus Phytoplasma'. J Mol Microbiol Biotechnol. 2014;24(1):19-36
  Kube M, Siewert C, Migdoll AM, Duduk B, Holz S, Rabus R, Seemüller E, Mitrovic J, Müller I, Büttner C, Reinhardt R
  
• Complete genome determination and analysis of Acholeplasma oculi strain 19L, highlighting the loss of basic genetic features in the Acholeplasmataceae. BMC Genomics. 2014 Oct 24;15:931
  Siewert C, Hess WR, Duduk B, Huettel B, Reinhardt R, Büttner C, Kube M
  
• Generation and analysis of draft sequences of 'stolbur' phytoplasma from multiple displacement amplification templates. J Mol Microbiol Biotechnol. 2014;24(1):1-11
  Mitrović J, Siewert C, Duduk B, Hecht J, Mölling K, Broecker F, Beyerlein P, Büttner C, Bertaccini A, Kube M
  
• Transcriptomics assisted proteomic analysis of Nicotiana occidentalis infected by Candidatus Phytoplasma mali strain AT. Proteomics. 2014 Aug;14(16):1882-9
  Luge T, Kube M, Freiwald A, Meierhofer D, Seemüller E, Sauer S
  
• Differentiation of 'Candidatus Phytoplasma cynodontis' based on 16S rRNA and groEL genes and identification of a new subgroup, 16SrXIV-C. Plant Disease, online published in May 2015
  Mitrović J, Smiljković M, Seemüller E, Reinhardt R, Hüttel B, Büttner C, Bertaccini A, Kube M, Duduk B