Struktur und Funktion einer bakteriellen Ionen (Na+)-translozierenden Ferredoxin: NAD+-Oxidoreduktase (Rnf)

• Antragsteller: Professor Dr. Volker Müller
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 206018227

Das anaerobe acetogene Bakterium Acetobacterium woodii lebt an der thermodynamischen Grenze des Lebens. Während des autotrophen Wachstums ist die Netto-ATP-Synthese durch Substratkettenphosphorylierung Null, und es wird vermutet, dass eine einfache Atmungskette bestehend aus einer Na+-Ferredoxin:NAD-Oxidoreduktase und einer Na+-F1FO-ATP-Synthase eine zusätzliche, wenn auch bescheidene Netto-Synthese von ATP ermöglicht (0.3 Mol/Mol Acetat). Unsere eigenen früheren Studien gaben starke Hinweise darauf, dass die Ferredoxin:NAD-Oxidoreduktase von den rnf-Genen kodiert wird. Schon in den 1980er Jahren wurde vermutet, dass die rnf-Gene ein respiratorisches Enzym mit Ähnlichkeit zur Na+-translozierenden NADH:Chinon-Oxidoreduktase kodieren. Die rnf-Gene sind weit verbreitet in Bakterien und auch in einigen Archaeen zu finden, aber über die physiologische Rolle und biochemische Funktion des Rnf-Komplexes ist sehr wenig bekannt. In der letzten Antragsperiode haben wir die physiologische Rolle von Rnf in A. woodii untersucht und die Biochemie und Bioenergetik der Reaktion charakterisiert. Die Entwicklung eines verlässlichen Enzymtests erlaubte den zweifelsfreien Nachweis der Na+-Abhängigkeit der Elektronentransfer-Reaktion. Deletionsanalysen in einem Bakterium und einem Archaeon erbrachten den Beweis, dass die rnf-Gene tatsächlich die Ferredoxin:NAD-Oxidoreduktase-Aktivität kodieren. Ein weiterer Durchbruch war die Anreicherung eines Na+-abhängigen Rnf-Komplexes aus Thermotoga maritima, wobei die Präparation auch noch die zweite Komponente der Atmungskette, die Na+-F1FO-ATP-Synthase enthielt. Eine besonders wichtige Beobachtung war, dass der kovalent-bindende Hemmstoff Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD) die Ferredoxin:NAD-Oxidoreduktase-Aktivität inhibierte und dass die Inhibierung in Gegenwart von Na+ aufgehoben war. Ein weiterer Meilenstein war die Etablierung eines genetischen Systems zur homologen Proteinproduktion in A. woodii, was die Tür zu einer molekularen Struktur-Funktionsanalyse des Rnf-Komplexes aus A. woodii öffnet. Der vorliegende Fortsetzungsantrag baut auf den genannten Vorarbeiten auf und verfolgt zwei Ziele. Unsere Rnf/ATP-Synthase-Präparation eröffnet die einzigartige Möglichkeit, die Hypothese zu überprüfen, dass Rnf und ATP-Synthase eine funktionelle Atmungskette bilden. Dazu werden Rnf und ATP-Synthase aus T. maritima in Liposomen ko-rekonstituiert und die Atmungskette wird charakterisiert. Zweitens wird die beobachtete Kompetition von Na+ und DCCD um den gleichen Bindungsort genutzt, um die Na+-bindende Untereinheit und Aminosäure in Rnf zu finden. Das etablierte System zur homologen Proteinproduktion in A. woodii wird optimiert und dann genutzt, um die biochemische Identifikation der Na+-bindenden Untereinheit/Aminosäure zu verifizieren und zusätzliche zu finden. Unsere Daten werden detaillierte Einsichten in die Funktion eines für viele Anaerobe wichtigen, aber weitestgehend uncharakterisierten Atmungskettenenzyms liefern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen