Charakterisierung des CRISPR-Cas Typ I-B DNA Interferenzkomplexes aus Clostridium thermocellum

• Antragsteller: Professor Dr. Lennart Randau
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Mikrobielle Ökologie und Angewandte Mikrobiologie
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 192503913

Archaeen und Bakterien können adaptive CRISPR-Cas Immunsysteme besitzen. Diese vielfältigen Systeme benutzen kleine CRISPR RNA Moleküle die an einem Cas Proteinkomplex gebunden sind, um Virenangriffe zu erkennen und um Fremd-DNA abzubauen. Unsere Untersuchungen konzentrieren sich auf den Typ I-B DNA Interferenzkomplex "Cascade" aus Clostridium thermocellum. Wir haben die rekombinante Produktion der fünf Proteinuntereinheiten (Cas3, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8b) und die in vitro Generierung von CRISPR RNA Transkripten dieses Ribonukleoproteinkomplexes etabliert. Dabei wird das Subtyp-spezifische Protein Cas8b in zwei Fragmenten hergestellt und die Trennungsstelle wurde auch in anderen Cas8b Proteinen identifiziert. Wir planen Mutationsstudien der Protein- und Nukleinsäurekomponenten dieses rekombinanten Komplexes um die funktionellen Rolle(n) einzelner Cas Proteine in Cascade untersuchen zu können. Ziel ist es die Mechanismen und die Spezifizität (i) der DNA Zielerkennung und (ii) der Beladung mit CRISPR RNA in Cascade zu verstehen. Dabei wird besonders die unbekannte Rolle der Subtyp-spezifischen großen Untereinheit Cas8b in diesen Prozessen analysiert. Wir postulieren, dass die Cas8b Fragmentierung die fehlende kleine Untereinheit generiert, wobei Voruntersuchungen auf eine selbstschneidende Aktivität hinweisen. Cas8b Mutanten ohne interne Schneideaktivität sowie Proteinfragmente die isolierten kleinen und großen Untereinheiten entsprechen können in DNA Interferenzkomplexen integriert werden. Mittels in vitro DNA Binde- und Schneideassays soll die Rolle der kleinen und großen Cascade Untereinheiten in der DNA Zielerkennung untersucht werden. Diese Studien ermöglichen es uns die Substratselektivität von DNA Interferenzkomplexen des Typs I-B und des vorher in unserem Labor rekonstituierten Typ I-A Komplexes aus Thermoproteus tenax zu vergleichen. Wir planen mit Mitgliedern der DFG Forschergruppe FOR1680 zu kollaborieren um (i) die Interaktionsstellen zwischen CRISPR RNA und C. thermocellum Cas Proteinen mittels Massenspektrometrie zu identifizieren und (ii) um die funktionalen Rollen der kleinen und großen Untereinheiten von DNA Interferenzkomlexen in vivo zu untersuchen. Der Vergleich unterschiedlicher DNA Interferenzmechanismen verspricht neuartige Einblicke in (i) die Grundlage der Diversifizierung der CRISPR-Cas Systeme und (ii) den Grad der Flexibilität in DNA Zielerkennung, welches zum Beispiel eine Hauptfragestellung in CRISPR-Cas vermittelter Gentherapie ist.

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 1680: Unravelling the prokaryotic immune system