Bedeutung GTPase-aktivierender Proteine (GAPs) mit BAR-Domäne für die Thrombozytenfunktion
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Thrombozytenaktivierung und Thrombusbildung spielt eine entscheidende Rolle in der Hämostase und arteriellen Thrombose. Hierbei sind die Aktin-basierten Zytoskelett-gesteuerten morphologischen und funktionellen Veränderungen aktivierter Thrombozyten von großer Bedeutung. Kleine GTPasen der Rho Familie sind wichtige Regulatoren der Reorganisation des Zytoskeletts, modulieren aber auch die Integrinaktivierung, Degranulierung und PLC 2 Aktivierung in Thrombozyten. Die Regulation der Aktivität von Rho GTPasen erfolgt über regulatorische Proteine wie z. B. den GAPs, die die Signalübertragung von RhoA, Rac1 und Cdc42 inhibieren. In Thrombozyten ist jedoch nur wenig über die Regulation von Rho GTPasen bekannt. Wir konnten zeigen, dass die GAPs mit BAR Domäne OPHN1 und Nadrin in Thrombozyten exprimiert werden und mit Aktinstrukturen im Thrombozyten ko-lokalisieren. In Überexpressionsstudien in der thrombozytären Modell-Zelllinie A5CHO zeigte sich eine Regulation von RhoA, Rac1 und Cdc42 durch OPHN1 und Nadrin. Über die Regulation der Aktivität von Rho GTPasen spielen OPHN1 und Nadrin eine wichtige Rolle bei der Zelladhäsion und –spreading sowie bei der Bildung von Stressfasern und fokalen Adhäsionskomplexen. Eine Regulation der GAP Aktivität erfolgt bei OPHN1 und Nadrin zum einen über die BAR Domäne in einem intramolekularen Wirkmechanismus sowie über eine Src Kinase vermittelte Phosphorylierung der BAR- und GAP Domäne. Durch die Generierung von Phosphomutanten konnten wir zeigen, dass eine Phosphorylierung von OPHN1 zu einer verstärkten GAP Aktivität mit nachfolgend veränderter Zelladhäsion und Pseudopodienbildung führt. Die Src-vermittelte Phosphorylierung von Nadrin ist Substrat- und Isoform-spezifisch. Die Phosphorylierung von Nadrin Isoform 5 induziert die Inaktivierung von Cdc42, während es zu einer Aktivierung von RhoA und Rac1 durch Nadrin Isoform2 Phosphorylierung kommt. Untersuchungen im knock-out Mausmodell ergaben, dass Ophn1-/- Thrombozyten eine erhöhte Aktivität von RhoA, Rac1 und Cdc42 im Ruhe- wie im Aktivitätszustand aufweisen. Dies führt zu einer erhöhten Dynamik bei der Zelladhäsion und beim Spreading, beeinflusst aber auch die Thrombozytenaktivität, insbesondere bei Stimulation des Kollagenrezeptors GPVI. Dadurch kommt es zu einer verstärkten Thrombusbildung auf Kollagen unter Flussbedingungen ex vivo und zu einer reduzierten Okklusionszeit in einem Mausmodell der arteriellen Thrombose. Des Weiteren konnten wir feststellen, dass es neben den Veränderungen in der arteriellen Thrombose auch zu einer verkürzten Blutungszeit (Hämostase) durch OPHN1 Defizienz kommt. OPHN1 beeinflusst aber auch die Inflammation und Apoptose nach experimentellen Myokardinfarkt (LAD Ligatur). Im Vergleich zu Kontrolltieren führt eine verstärkte Migration von inflammatorischen Zellen sowie eine verstärkte Apoptose in der Infarktzone von Ophn1-/- Tieren jedoch nicht zu einer Veränderung der Infarktgröße sowie der Herzfunktion nach 21 Tagen Reperfusion. Um die Thrombozytenfunktion und arterielle Thrombose auch in Nadrin-/- Tieren untersuchen zu können, haben wir mittels Embryotransfer eine tm1a Mauslinie generiert, die derzeit mit einer Cre-Deleter Maus verpaart wird. Eine detaillierte Analyse der Nadrin-/- Tiere wird dann ab Herbst 2014 erfolgen. Des Weiteren werden die vielversprechenden Ergebnisse der Ophn1-/- Tiere genutzt und durch Experimente mit retroviralem Gentransfer in knochenmarkchimären Tieren ergänzt, um durch Überexpression von OPHN1 in Thrombozyten zu testen, ob OPHN1 als neue antithrombotische Therapiestrategie in Frage kommt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Entwicklung eines adhäsions-modulierenden Proteins zur Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen: Oligophrenin "OPHN1 (5402P476)", Patent
M. Elvers, M. Gawaz, A. Fotinos, S. Beck
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Cyclophilin A is a Ca2+ regulator in platelets involved in arterial thrombosis. Blood 2012 Aug 9;120(6):1317-26
M. Elvers, A. Herrmann, P. Seizer, P. Münzer, S. Beck, O. Borst, F. Lang, A. May, M. Gawaz
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Isoform-specific roles of the GTPase activating protein Nadrin in cytoskeletal reorganization of platelets. Cell Signal. 2012 Sep 10
S. Beck, A. Fotinos, F. Lang, M. Gawaz, M. Elvers
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The GRAF family member Oligophrenin1 is a RhoGAP with a BAR domain and regulates Rho GTPases in platelets. Cardiovasc Res. 2012 Jun 1;94(3):526-36
M. Elvers, S. Beck, A. Fotinos, M. Ziegler, M. Gawaz
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Nadrin GAP activity is isoform- and target- specifically regulated by tyrosine phosphorylation. Cell Signal. 2014 Apr 2. pii: S0898-6568(14)00126-0
S. Beck, A. Fotinos, M. Gawaz, M. Elvers
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Loss of Oligophrenin1 leads to uncontrolled Rho activation and increased thrombus formation in mice. J Thromb Haemost., Vol 13 Issue 4, April 2015, Pages 619-630
A. Fotinos, M. Klier, N.S. Gowert, P. Münzer, C. Klatt, S. Beck, O. Borst, P. Billuart, M. Schaller, F. Lang, M. Gawaz, M. Elvers
