Multifokal-Multiphotonen-Mikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Multifokal-Multiphotonen-System wurde seit der Inbetriebnahme 2012 v.a. als Multiphotonen-Mikroskop eingesetzt, um statische Untersuchungen zur 3D Struktur und Remodeling von Zellen und Geweben in chronisch entzündlichen und degenerativen Erkrankungen zu charakterisieren. Wissenschaftlich lag hier bisher der Fokus auf Untersuchungen von Muskelzellen und Muskelgewebs-Schnitten von genetischen Mausmodellen myofibrillärer Myopathien, insbesondere der R350P Mutation im Desmin-Gen. Hier wurde eine altersabhängige Studie initiiert, die von uns entwickelte und weltweit einzigartige quantitativen Morphometrie der Muskelzell-Geometrie dahingehend einzusetzen, die 3D Zytoarchitektur von Muskelzellen des M. extensor digitorum longus und M. soleus bei heterozygoten und homozygoten DesR350P Mutanten zu vergleichen. Ziel ist hierbei, eine optisch validierte Voraussage zur progredienten Muskelschwäche bei myofibrillären Myopathien abzuleiten als neue Bilddiagnostik mit subzellulärer Auflösung. In einem weiteren Kooperationsprojekt mit der Inneren Medizin I werden Darmbiospien von Patienten mit endoskopisch diagnostizierten entzündlichen Darmerkrankungen (M. Crohn, Colitis ulcerosa) auf ultrastrukturelle Veränderungen hin untersucht. Hier, wie beim Muskelprojekt, werden v.a. nicht-lineare optische Signale intrinsischer Proteine im Gewebe induziert und detektiert, die sog. Second Harmonic Generation (SHG) Signale, welche von endogenem Kollagen und Myosin ausgehen. Hierdurch wird eine Label-freie Darstellung der Zyto- und Gewebsarchitektur möglich. In einem weiteren Projekt wird das System seit Inbetriebnahme im Bereich Tissue Engineering mit Biomaterialien eingesetzt, um die Schnittstelle von Zellen mit den Scaffolds zu charakterisieren. Scaffolds aus verschiedenen Biomaterialien-Kompositen werden dabei mit Zellen, v.a. Stammzellen (mesenchymale, osteogene Vorläuferzellen) besiedelt und im Zeitverlauf dargestellt. Besonders vorteilhaft ist dabei die Verwendung des gepulsten Infrarot-Lasers mit deutlich höherer Eindringtiefe im Vergleich zu konventioneller Konfokalmikroskopie und die Auslese der Label-freien SHG Signale sowie zellulärer Autofluoreszenz-Signale. Letztere erlauben die Darstellung der Zellbesiedlung bis tief in die Scaffolds hinein (~100-50 µm). Dabei werden verschiedene Besiedlungs- und Differenzierungs-Bedingungen optimiert und optisch validiert. Ein weiteres wichtiges Forschungsprojekt widmet sich der Untersuchung von zellulären Struktur-Veränderungen und Zell-Signalen (z.B. Ca2+ Regulation) unter hohen hydrostatischen Drücken. Dieser Bereich der Hochdruck-Biologie erfordert zur Messung von Multiphotonen-Fluoreszenz und SHG-Signalen die Konstruktion einer passgenauen optischen Druck-Kammer, welche in den Strahlengang eingepasst werden kann. Diese Hochdruckkammer zu konstruieren, stellt den ersten Baustein in diesem Projekt dar. Nach in vitro Testungen der Druckstabilität und Multiphotonen-Anregung von Farbstoff-Lösungen mit dem Großgerät werden dann erregbare Zellen (Muskelzellen, Neurone) in dieser Hochdruck-Kammer optisch mit dem Multiphotonen-Mikroskop unter hyperbaren Bedingungen vermessen. Hierzu wird an das Mikroskop-System ein externer Druckerzeuger in dem Projekt angeschlossen und intergiert. Es ist geplant, hierbei die Zellreaktionen bei Druckexpositionen und Druckprofilen zu untersuchen, welche den Druckbelastungen im Tiefseebereich an zelluläre Systeme entsprechen. In einem weiteren, Universitäts-intern geförderten Emerging Fields Projekt, wird das System um versatile Endoskop-Optiken erweiter, welche dazu dienen sollen, eine Multiphotonen-basierte Endoskopie technologisch im proof-of-concept Verfahren am Standort zu etablieren, bevor die Mikroskopie in eine Endomikroskopie miniaturisiert wird. Hierzu werden am Gerät v.a. GRIN Linsen Erweiterungen eingekoppelt und die Laser-Einkopplung an Glasfasern (photonic crystal fibres) simuliert und getestet. In einem aktuellen Projekt wird nun auch der Multistrahlbetrieb des Systems zusehends dazu eingesetzt, schnelle Fluktuationen von Ca2+ in Muskelzellen mit Ca2+-Fluoreszenz-Farbstoffen aufzulösen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Estimating the 3D pore size distribution of biopolymer networks from directionally biased data. Biophys J 105(9), 1967-1975 (2013)
Lang NR, Münster S, Metzner C, Krauss P, Schürmann S, Lange J, Aifantis KE, Friedrich O, Fabry B
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From chaos to split-ups-SHG microscopy reveals a specific remodelling mechanism in ageing dystrophic muscle. J Pathol 229(3), 477-485
Buttgereit A, Weber C, Garbe CS, Friedrich O
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Gastroenterology 145(3), 514-516 (2013)
Schürmann S, Foersch S, Atreya R, Neumann H, Friedrich O, Neurath MF, Waldner MJ
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Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the esign and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface 10(86): 20130263 (2013)
Vielreicher M, Schürmann S, Detsch R, Schmidt MA, Buttgereit A, Boccaccini A, Friedrich O
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A novel quantitative morphometry approach to assess regeneration in dystrophic skeletal muscle. Neuromuscul Disord 24(7), 596-603 (2014)
Buttgereit A, Weber C, Friedrich O
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L-1α reversibly inhibits skeletal muscle ryanodine receptor. a novel mechanism for critical illness myopathy? Am J Respir Cell Mol 50(6) 1096-1106
Friedrich O, Yi B, Edwards JN, Reischl B, Wirth-Hücking A, Buttgereit A, Lang R, Weber C, Polyak F, Liu I, von Wegner F, Cully TR, Lee A, Most P, Völkers M
