Analytische Ultrazentrifuge mit Fluoreszenzdetektion
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die analytische Ultrazentrifuge dient der Bestimmung molarer Massen von Biomolekülen als isolierte Spezies oder in Komplexen. Durch die spezielle Ausstattung des Gerätes mit einer Fluoreszenzoptik lassen sich die Reaktionen fluoreszenzmarkierter Moleküle in komplexen Lösungen quantifizieren, dies ist insbesondere für Wechselwirkungen von (fluoreszenzmarkierten) Nukleinsäuren mit Proteinen, aber auch für Protein-Protein-Wechselwirkungen interessant. So war einer der Schwerpunkte für den Einsatz der analytischen Ultrazentrifuge die Charakterisierung der Wechselwirkung viraler Nukleinsäuren mit viralen und zellulären Proteinen, welche an der Replikation des viralen Genoms beteiligt sind. Durch die biophysikalische Quantifizierung dieser Wechselwirkung zusammen mit funktionellen und strukturellen Studien konnten neue Erkenntnisse zur Replikation des Hepatitis C Virus gewonnen werden. Auch die Interaktionen viraler Proteine des Polyomavirus, die für den Aufbau einer Virushülle wichtig sind, konnten so quantifiziert werden. Ein zweiter Schwerpunkt war die Darstellung und Quantifizierung von Rezeptor-Liganden- Wechselwirkungen. Als Beispiel sein hier das System aus Tollrezeptor und seinem Proteinliganden Spätzle genannt, welches eine zentrale Rolle in der Entwicklung und im Immunsystem von Drosophila spielt. So konnte mit Hilfe der analytischen Ultrazentrifugation festgestellt werden, dass der Tollrezeptor in vitro im Wesentlichen als Monomer vorliegt mit einer nur sehr schwachen Tendenz zur spontanen Dimerisierung. Durch Bindung des Liganden Spätzle wird diese Dimerisierung induziert; sowohl die Affinität des Rezeptor- Liganden Komplexes als auch dessen Stöchiometrie konnten bestimmt werden. Zusammen mit der Kristallstruktur des Komplexes konnte so ein molekulares Modell zur Aktivierung des Tollrezeptors durch Spätzle postuliert werden. Darüber hinaus wurde die analytische Ultrazentrifuge umfangreich in Routinemessungen zur Bestimmung des Molekulargewichtes bzw Assoziationszustandes einer Vielzahl von Proteinen eingesetzt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2013) Identification of Drosophila and human 7-methyl GMP-specific nucleotidases. J. Biol. Chem., 288, 2441-2451
Buschmann, J., Moritz, B., Jeske, M., Lilie, H., Schierhorn, A. & Wahle, E.
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(2014) Biophysical Characterization of Polyomavirus Minor Capsid Proteins. Biol. Chem., 395, 871-880
Burkert, O., Kreßner, S., Sinn, L., Giese, S., Simon, C. & Lilie, H.
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(2014) Characterisation and disulfide linkage of highly stable yeast derived VLPs of Murine Polyomavirus. J. Biol. Chem., 289, 10411-10418
Simon, C., Klose, T., Herbst, S., Han, B.G., Sinz, A., Glaeser, R., Stubbs, M.T & Lilie, H.
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(2014) Initiation of RNA synthesis by the hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase is affected by the structure of the RNA template. Biochemistry, 53, 7002-7012
Reich, S., Kovermann, M., Lilie, H., Knick, P., Geissler, R., Golbik, R.P., Balbach, J. & Behrens, S.E.
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(2014) Structure of the Toll-Spätzle complex, a molecular hub in Drosophila development and innate immunity. PNAS, 111, 6281-6286
Parthier, C., Stelter, M., Ursel, C., Fandrich, U., Lilie, H., Breithaupt, C. & Stubbs, M.T.
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(2015) Solution structure of the PsIAA4 oligomerization domain reveals interaction modes for ranscription factors in early auxin response. PNAS 112, 6230-6235
Dinesh, D.C., Kovermann, M., Gopalswamy, M., Hellmuth, A., Calderon V., Luz I.A., Lilie, H., Balbach, J. & Abel, S.
