Analytische Ultrazentrifuge mit Fluoreszenzdetektion
Final Report Abstract
Die analytische Ultrazentrifuge dient der Bestimmung molarer Massen von Biomolekülen als isolierte Spezies oder in Komplexen. Durch die spezielle Ausstattung des Gerätes mit einer Fluoreszenzoptik lassen sich die Reaktionen fluoreszenzmarkierter Moleküle in komplexen Lösungen quantifizieren, dies ist insbesondere für Wechselwirkungen von (fluoreszenzmarkierten) Nukleinsäuren mit Proteinen, aber auch für Protein-Protein-Wechselwirkungen interessant. So war einer der Schwerpunkte für den Einsatz der analytischen Ultrazentrifuge die Charakterisierung der Wechselwirkung viraler Nukleinsäuren mit viralen und zellulären Proteinen, welche an der Replikation des viralen Genoms beteiligt sind. Durch die biophysikalische Quantifizierung dieser Wechselwirkung zusammen mit funktionellen und strukturellen Studien konnten neue Erkenntnisse zur Replikation des Hepatitis C Virus gewonnen werden. Auch die Interaktionen viraler Proteine des Polyomavirus, die für den Aufbau einer Virushülle wichtig sind, konnten so quantifiziert werden. Ein zweiter Schwerpunkt war die Darstellung und Quantifizierung von Rezeptor-Liganden- Wechselwirkungen. Als Beispiel sein hier das System aus Tollrezeptor und seinem Proteinliganden Spätzle genannt, welches eine zentrale Rolle in der Entwicklung und im Immunsystem von Drosophila spielt. So konnte mit Hilfe der analytischen Ultrazentrifugation festgestellt werden, dass der Tollrezeptor in vitro im Wesentlichen als Monomer vorliegt mit einer nur sehr schwachen Tendenz zur spontanen Dimerisierung. Durch Bindung des Liganden Spätzle wird diese Dimerisierung induziert; sowohl die Affinität des Rezeptor- Liganden Komplexes als auch dessen Stöchiometrie konnten bestimmt werden. Zusammen mit der Kristallstruktur des Komplexes konnte so ein molekulares Modell zur Aktivierung des Tollrezeptors durch Spätzle postuliert werden. Darüber hinaus wurde die analytische Ultrazentrifuge umfangreich in Routinemessungen zur Bestimmung des Molekulargewichtes bzw Assoziationszustandes einer Vielzahl von Proteinen eingesetzt.
Publications
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