Mode of action of the serine protease autotransporter EspP from enterohemorrhagic Escherichia coli
Final Report Abstract
Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) sind bedeutende Zoonose Erreger, die in der Regel über kontaminierte Lebensmittel übertragen werden und zu lebensbedrohlichen Krankheitsverläufen wie dem hämolytisch-urämischen Syndrom führen können. Shiga-Toxine sind als Hauptvirulenzfaktoren identifiziert worden, für die Pathogenese einer EHEC-Infektionen sind weitere Virulenzfaktoren aber ebenfalls von Bedeutung. In diesem Projekt wurde der von hochpathogenen EHEC exprimierte Serinprotease Autotransporter EspP, Subtyp α, eingehend hinsichtlich seines Substratspektrums und der Substraterkennung untersucht. Darüber hinaus wurden endogene Einflussfaktoren im Wirt charakterisiert, die die Expression von espPα beeinflussen können. Ein weiteres Ziel war die Untersuchung der Fähigkeit von EspPα zur Interaktion mit zellulären Oberflächen und die Charakterisierung funktionaler Unterschiede zum Serinprotease Autotransporter EspI, der ebenfalls von EHEC sezerniert wird. Insgesamt konnten 17 physiologisch relevante Substrate von EspPα in humanem Plasma und Thrombozyten identifiziert werden. Ein wesentlicher Fortschritt in dem Verständnis der Wirkungsweise von EspPα war der Befund, dass die identifizierten Substrate insgesamt ein funktionales Netzwerk im Bereich der Hämostase, Immunabwehr und Inflammation bilden. Ein Beispiel für die Interferenz von EspPα mit der Hämostase ist die spezifische Spaltung und Inaktivierung verschiedener prokoagulatorischer Serpine (α-1 Proteaseinhibitor, A-2 Antiplasmin und weitere) während antikoagulatorische Serpine (Antithrombin III) nicht gespalten werden. Die detaillierte Untersuchung der Substratspezifität von EspPα am Beispiel der Spaltung von P-Selektin hat gezeigt, dass die Substraterkennung nicht ausschließlich über die Peptidsequenz um die Spaltstelle erfolgt, sondern das die Sekundärstruktur und ggf. auch die Tertiärstruktur des Substrates eine zentrale Rolle spielt. P-Selektin wird als Substrat von EspPα nur erkannt, wenn die Domäne, in der gespalten wird, vollständig und in korrekter Tertiärstruktur vorliegt. Teilsequenzen dieser Domäne (short consensus repeat 6) werden als Substrat ebenso wenig erkannt wie eine reduzierte und alkylierte Form von scr6. Eine Ausnahme von dieser Regel bilden Tripeptide mit entsprechender Erkennungssequenz, die offenbar sterisch nicht am Zugang zum aktiven Zentrum gehindert werden. Dies belegen auch kinetische Daten zur Spaltung des intakten P-Selektin und des entsprechenden Peptides QPL-pNA. Darüber hinaus konnte aus den massenspektrometrischen Daten zur Substratspaltung auch die bevorzugte Erkennungssequenz identifiziert werden. Bezüglich der Regulation der Expression von espPα konnte eine geringfügige aber signifikante Induktion sowohl durch bakterielle Autoinducer (quorum sensing) als auch durch Epinephrin als einem bekannten Faktor des interkingdom signalling identifiziert werden. Insgesamt ist der Stimulus durch Zell-Zell-Kontakt von EHEC mit Zellen des Darmepithels auf die Expression von EspPα allerdings deutlich ausgeprägter. Lösliche Faktoren nach Lyse von Epithelzellen konnten in diesem Projekt als relevante Induktoren dieses Stimulus ausgeschlossen werden. Hinsichtlich der Interaktion von EspPα mit zellulären Oberflächenstrukturen wurden nach Untersuchung mittels Fluoreszenzmikroskopie mit Fluoreszenz-markiertem EspPα keine spezifischen Interaktionen detektiert. In der Gesamtschau konnte in diesem Projekt gezeigt werden, dass EspPα hochspezifisch und effektiv zentrale Faktoren der Hämostase, Inflammation und innaten Immunantwort spaltet und inaktiviert und hierüber einen Beitrag zur Pathogenese von EHEC leisten dürfte.
Publications
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(2013) Funktionale Charakterisierung der Serinprotease-Autotransporter EspPα und EspI aus enterohämorrhagischen Escherichia coli, Dissertationsschrift
Weiss, A.
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(2013) Prevalence, Biogenesis and Functionality of the serine protease autotransporter EspP. Toxins 5 (1), 25-48
Weiss A, Brockmeyer J
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(2014) Biochemical Characterization of the SPATE members EspPα and EspI. Toxins 6 (9), 2719-2731
Weiss A, Kortemeier, D, Brockmeyer J
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(2014) Structural and functional characterization of cleavage and inactivation of human serine protease inhibitors by the bacterial SPATE protease EspPα from enterohemorrhagic E. coli. Plos One 9 (10)e111363
Weiss A, Joerss, H, Brockmeyer J
