Analyse der funktionellen Homogenität myogen differenzierter Stammzellpopulationen und ihrer funktionellen Integration in einen myogenen Zellverband
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die erfolgreiche Differenzierung stammzellabgeleiteter Zellen in unterschiedliche Zelltypen wird in der Regel durch den biochemischen, molekularbiologischen oder immunzytochemischen Nachweis zellspezifischer Marker demonstriert. Bei elektrisch erregbaren Zellen wie Neuronen oder Muskelzellen dienen dabei oft Bestandteile des Zytoskeletts als typische Marker. Der Nachweis der Zelltypspezifität auf mRNA oder Proteinebene erlaubt allerdings keine Aussage über den funktionellen Differenzierungszustand von Stammzell-abgeleiteten Zellen. Für die Funktion und funktionsgerechte Integration elektrisch erregbarer Zellen in einen Gewebeverband ist vor allem das Vorhandensein von zelltypischen spannungs- und ligandgesteuerten Ionenkanälen und deren orchestrierte Interaktion ausschlaggebend. Bei Muskelzellen ist eine zusätzliche wichtige Kenngröße die elektromechanische Kopplung, d.h. die auf ein Aktionspotential folgenden Kontraktion der Zelle, die durch eine Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration ausgelöst wird. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass aus adulten Knochenmarkszellen differenzierte Herzmuskelzellen zwar die typischen zytoskeletalen Marker und sogar Natrium- und Calciumkanalproteine exprimierten, die Zellen aber funktionell nicht aktiv waren, da es zu keiner elektromechanischen Kopplung kommt. Dies verdeutlicht wie wichtig es ist, für die Bewertung einer erfolgreichen und effizienten Differenzierung von Stammzellen auch relevante biophysikalische und funktionelle Parameter heranzuziehen. Dies war Ziel des Querschnittprojekts 2. Aus eigenen Vorarbeiten wussten wir, dass die Expression funktioneller Marker wie z.B. Ionenkanälen, von unterschiedlichen externen Faktoren abhängen kann; so z.B. der Art der Kultivierung, der Position einer Zelle in einem Gewebeverband und der Beschichtung der Kulturgefäße. Im Querschnittprojekt 2 wurden daher myogen differenzierende Zellen bezüglich ihrer funktionellen Parameter in Abhängigkeit von unterschiedlichen Differenzierungs-protokollen mit Hilfe von elektrophysiologischen Messverfahren charakterisiert. Unsere elektrophysiologischen Analysen bestätigen die Ausgangshypothese, dass es spezifische Marker-Ionenströme gibt, die den Grad der muskulären Differenzierung anzeigen. So war z.B die Natriumstromdichte auf undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen nur gering und lediglich in ~50% der Zellen nachweisbar, während die Referenzkultur glatter Muskelzellen über eine statistisch signifikant höhere Natriumstromdichte verfügte und Natriumströme bei allen gemessenen Zellen gefunden wurden. Die Natriumstromdichte von differenzierten Zellen nahm während der in vitro Differenzierung bis zum Tag 6 stetig zu. Aus diesem Grund kann der Natriumstrom in Zukunft als potentieller Indikatorstrom für die Evaluation des Differenzierungsfortschrittes von MSCs hin zu glatten Muskelzellen betrachtet werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2013) Cell based therapy for the deficient urinary sphincter. Current Urology Reports 14(5): 476 – 487
Hart M. L., Neumayer K.M.H., Vaegler M., Daum L., Amend B., Sievert K.D., DiGiovanni S, Kraushaar U., Guenther E., Stenzl A., Aicher W.K.
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(2015) Smooth muscle-like cells generated from human mesenchymal stromal cells display marker gene expression and electrophysiological competence comparable to bladder smooth muscle cells. PlosOne 10(12):e0145153
Brun J, Lutz KA, Neumayer KMH, Klein G, Seeger T, Uynuk-Ool T, Wörgötter K, Schmid S, Kraushaar U, Guenther E, Rolauffs B, Aicher WK, Hart ML
