On-Chip Expression of Transcription Factors and Force-Based Interaction Analysis with DNA
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das vorrangige Ziel des Antrags war, zu einem besseren biophysikalischen Verständnis der Genregulation auf der Ebene der Wechselwirkung von Transkriptionsfaktoren und der DNA beizutragen. Die quantitative Bestimmung der Wechselwirkung zwischen regulatorischen Proteinen und der DNA - und hier im Besonderen die wirkenden Bindungskräfte - sollte den Zugang liefern. Dazu war die Entwicklung eines geeigneten Assays im Parallelformat nötig. In der ersten Phase des Projekts gelang es uns, den differentiellen Krafttest in einen mikrofluidics chip zu integrieren und mit in-vitro Expression zu kombinieren. Im nächsten Schritt konnten wir diesen Assay mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop integrieren. Mit diesem Aufbau untersuchten wir als erstes Projekt den Einfluss der Hydroxymethylierung der Basen auf die Stabilität von DNA-Duplexen. Im Besonderen wurden Zahl und Position der Modifikationen genauer untersucht. Motiviert waren wir von der Möglichkeit in künftigen Projekten methylierungsspezifische Transkriptionsfaktoren identifizieren zu können. In Kooperation mit der Gruppe von Klaus Schulten wurden die Messungen mit steered Molecular Dynamics Simulationen untermauert und interpretiert. Wir konnten zeigen, dass je nach Position und Anzahl der Modifikationen die mechanische Stabilität sowohl erniedrigt als auch erhöht werden kann. Um Protein-basierte Alternativen zu den DNA-Referenzkomplexem im differentiellen Krafttest zu implementieren charakterisierten wir die Bindung von GFP und nanobodies. Letztere können vergleichsweise einfach in verschiedenen Mutationen exprimiert werden und können somit als Basis für ein Spektrum von Referenzkräften dienen. Die Transkriptionsfaktoren für unsere Experimente etablierten wir in unseren eigenen Laboren; wir begannen mit der Produktion der Proteine. Um den differentiellen Krafttest im Parallelformat an Modellsystemen auszutesten, bestimmten wir die Bindungskräfte von zwei Modellsystemen, der Endonuklease EcoR1 und dem Tumorsupressor P53. Wir konnten die Stabilisierung der Ziel-Duplexe durch simultane Messung gegen Referenzduplexe verschiedener Länge mit großer Genauigkeit quantifizieren. Als Nebenprojekt, mit denen wir Wartezeiten in der Proteinproduktion überbrückten, bestimmten wir die mechanische Stabilität des Adhäsionskomplexes von S.epdermidiis und konnten zeigen, dass die Protein-Domänen, die den SdrG-Rezeptor an der Bakterienoberfläche verankern, die stärksten bisher gemessenen Entfaltungskräfte von Proteinen aufweisen. Darüber hinaus konnten wir aufklären, welcher Hierarchie die drei Ca++ in der Stabilisierung der Domänen unterliegen. Insgesamt war dieses Projekt zwar nicht so geradlinig wie gewünscht verlaufen, aber wir nutzten die Chance und bauten die Proteinexpression an unserem eigenen Lehrstuhl aus. Darüber hinaus implementierten wir ganz zentrale Verbesserungen in unserem Assay, die schließlich zu wichtigen neuen wissenschaftlichen Erkenntnissen führten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Effects of Cytosine Hydroxymethylation on DNA Strand Separation. Biophysical Journal, 2013. 104(1): p. 208-215
Severin, P. M. D., Zou, X., Schulten, K. and Gaub, H. E.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.bpj.2012.11.013) - Stamping Vital Cells a Force-Based Ligand Receptor Assay. Biophysical Journal, 2013. 105(12): p. 2687-2694
Wienken, U. and Gaub, H. E.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.bpj.2013.10.013) - From genes to protein mechanics on a chip. Nature Methods, 2014 Nov;11(11):1127-1130
Otten Marcus, Ott Wolfgang, Jobst A Markus, Milles F Lukas, Verdorfer Tobias, Pippig A Diana, Nash A Michael, Gaub E Hermann
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/NMETH.3099) - Parallel Force Assay for Protein-Protein Interactions. Plos One, 2014. 9(12): p. 1-16
Aschenbrenner, D., Pippig, D. A., Klamecka, K., Limmer, K., Leonhardt, H. and Gaub, H. E.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.pone.0115049) - Calcium stabilizes the strongest protein fold. Nature Communications, November 2018
Lukas F. Milles, Eduard M. Unterauer, Thomas Nicolaus, Hermann E. Gaub
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/s41467-018-07145-6) - DNA-free directed assembly in single-molecule cut-and-paste. Nanoscale, December 2018
Erlich R. Katherine, Sedlak M. Steffen, Jobst A. Markus, Milles F. Lukas, Gaub E. Hermann
(Siehe online unter https://doi.org/10.1039/c8nr08636b)
