Molybdän-Transport und Mo-abhängige Genregulation in Bakterien

• Antragsteller: Dr. Bernd Masepohl
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 211163627

Die Biologische Stickstoff-Fixierung wird durch Nitrogenasen katalysiert, die chemisch inerten Luft-Stickstoff zu biologisch gut verfügbarem Ammonium reduzieren. Unser Modellorganismus, das photosynthetische Purpurbakterium Rhodobacter capsulatus, verfügt über zwei Nitrogenasen, eine Molybdän-abhängige und eine Mo-freie weniger effiziente Eisen-Nitrogenase, sowie über einen hochaffinen Mo-Transporter, welcher die Mo-Nitrogenase bei Mo-Mangel mit Molybdän versorgt. Rhodobacter synthetisiert zwei strukturell und funktionell eng verwandte NifA-Regulatoren, die sich hinsichtlich Aktivierung der Mo-Nitrogenase-Gene ersetzen können, während AnfA die Transkription der Fe-Nitrogenase-Gene aktiviert. Im Mittelpunkt dieses Antrags stehen FdxD- und Mo-abhängige Regulationsmechanismen, die das Verhältnis von NifA und AnfA bestimmen, und somit die Synthese der beiden Nitrogenasen balancieren.Der erste Antragsteil beschäftigt sich mit der Kontrolle von NifA und AnfA durch FdxD, ein Ferredoxin, das die Mo-Nitrogenase gegen Sauerstoff-Inaktivierung schützt. FdxD stimuliert die Akkumulation von NifA1 und NifA2 und reprimiert die Akkumulation von AnfA. FdxD fungiert somit als globaler Regulator, der das Verhältnis von NifA und AnfA, und damit die Expression der Mo- und Fe-Nitrogenasen koordiniert. Wir wollen die regulatorische Rolle von FdxD bei der Expression von Stickstoff-Fixierungsgenen (nif-Genen) klären, die durch NifA oder AnfA oder beide Regulatoren aktiviert werden. Daneben wollen wir die Beteiligung vermuteter Sauerstoff-sensierender Domänen in NifA (IDL) und AnfA (GAF) hinsichtlich FdxD-Kontrolle untersuchen.Der zweite Antragsteil beschäftigt sich mit dem Einfluß von Molybdän auf das Verhältnis von NifA und AnfA. Zum einen reprimiert Mo die anfA-Transkription. Zum anderen reprimiert AnfA die Akkumulation von NifA1 und NifA2. Dies deutet darauf hin, daß die NifA- und AnfA-Mengen abhängig vom zellulären Mo-Status aneinander angepaßt werden. Zur Aufschlüsselung dieses Mo-Effektes wollen wir die Expression von nif-Genen bei verschiedenen Mo-Konzentrationen in verschiedenen nifA- und anfA-Mutanten analysieren. Daneben soll die Rolle der GAF-Domänen in NifA und AnfA in Hinblick auf die NifA-Repression durch AnfA geklärt werden.Im dritten Antragsteil soll der Mechanismus der Mo-Kontrolle von IscN betrachtet werden. IscN unterstützt die Fe-Nitrogenase-Aktivität, wobei IscN möglicherweise als Donor von Eisen-Schwefel-Clustern dient. IscN ist das einzige Mo-reprimierte Produkt des iscN-nifU1-nifSVW-Operons, wobei die IscN-Menge vermutlich auf mRNA-Ebene reguliert wird. Diese Vermutung soll durch Identifizierung cis-regulatorischer Elemente über den Austausch des 5´ untranslatierten Bereichs und die Einführung neutraler Mutationen im Kodierbereich des iscN-Gens verifiziert werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen