In vivo Photoregulierung von Proteinstruktur und -funktion durch genetisch codierte photoschaltbare Click Aminosäure

• Antragsteller: Dr. Christian Hoppmann
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 211375240

Das Ziel des Projektes besteht in der gezielten in vivo Modifizierung von Proteinen zur Steuerung ihrer biologischen Aktivität mittels Licht. Hierfür sollen neuartige photoschaltbare Click Aminosäuren (PSCaa) ortsspezifisch mittels unnatürlicher Aminosäure-Mutagenese-Technik über orthogonale tRNA/Synthetasen Paare in das Proteinrückgrat eingebaut werden. Diese photoschaltbaren Click Aminosäuren bestehen aus einer Azobenzol-Einheit, die eine lichtaktivierbare Vinyl-Gruppe trägt, um mit einem benachbarten Cystein in einer intramolekularen Thiol-En Click Reaktion eine photoschaltbare Azobenzolbrücke bilden zu können. Die Selektivität dieses Vorgehens gegenüber dem gegenwärtig verwendeten Verfahren, der post-translationalen Verbrückung zweier Cysteine im Protein über ein zwei thiol-reaktive Gruppen tragendes Azobenzols, ist ein erheblicher Vorteil, da die Vielfalt der entstehenden Produkte beim gegenwärtigen Verfahren dessen Anwendbarkeit auf lebende Systeme stark limitiert. Für biologisch aktive Polypeptide konnten wir bereits zeigen, dass nach chemischem Einbau einer PSCaa die Ausbildung einer intramolekularen Brücke zum benachbarten Cystein spezifisch erfolgte und die Konformation und biologische Aktivität mittels Licht durch diese Brücke gesteuert werden konnte. Dieser neue Ansatz soll nun an einem Protein, das Calmodulin (CaM), das zwischen aktivem und nicht aktivem Zustand erhebliche Konformationsunterschiede aufweist, gezeigt werden. Bestandteil des Projektes ist die Entwicklung eines orthogonalen tRNA/Synthetase Paares für eine photoschaltbare Click Aminosäure. Damit werden CaM-Mutanten mit PSCaa-Cys Brücken in verschiedenen Positionen durch Expression in E.coli hergestellt und ihre lichtabhängige Affinität zu CaM bindenden Proteindomänen bestimmt. Schließlich wird eine Übertragbarkeit der Methodik auf Säugerzellen mit der besten CaM-Mutante mit dem Ziel untersucht, eine lichtabhängige Steuerung Calmodulin-spezifischer Funktionen in vivo demonstrieren zu können.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Lei Wang, Ph.D.