Struktur, Funktion und Interaktionspartner der Motor-ATPase PilF und des Sekretins PilQ in einem bakteriellen DNA Transporter

• Antragstellerin: Professorin Dr. Beate Averhoff
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 211427752

Der Erwerb neuen genetischen Materials spielt eine entscheidende Rolle bei der mikrobiellen Kolonisierung diverser, oft extremer Habitate. In extremophilen Bakterien wird der Gentransfer als Haupttriebkraft der Adaptation und Diversifizierung angesehen und ein DNA Transfer zwischen Vertretern aller drei Domänen wurde bereits vielfach beobachtet. Das thermophile Bakterium Thermus thermophilus besitzt einen DNA-Transporter, der DNA aus Vertretern aller drei Domänen transportiert. In der ersten Antragsphase wurden umfangreiche Struktur/Funktionsanalysen von zwei Schlüsselkomponenten des DNA-Transporters, der Motor-ATPase PilF und des Sekretins PilQ, durchgeführt. Beide bilden Komplexe. Um Hinweise auf die Struktur des PilF Komplexes zu erhalten, haben wir mit seiner Kristallisation begonnen und kürzlich erste Kristalle erhalten. Durch Röntgenstrukturanalysen sollen hochauflösende Strukturen gewonnen werden. PilF interagiert mit einer Membranplattform, aber die Interaktionspartner sind unbekannt. Wir konnten zeigen, dass die ATPase-Aktivität von PilF durch PilM und PilN stimmuliert wird und die Proteine co-eluieren, welches eine PilF-PilM-PilN Interaktion indiziert. Wir werden diese Hypothese verifizieren, indem PilFMN Komplexe gereinigt und ihre Interaktion und Struktur mittels biochemischer und elektronenmikroskopischer Methoden analysiert wird. Es gibt starke Hinweise, dass PilF DNA bindet. Wir werden diesen Befund verifizieren und seine Signifikanz beim DNA Transport analysieren. Es gibt bisher keine hochauflösende Struktur des PilQ Komplexes. Kürzlich konnten wir erste Kristalle des PilQ Komplexes erhalten, und durch Röntgenstrukturanalysen sollen hochauflösende Strukturen gewonnen werden. Wir haben ein Reinigungsprotokoll für PilQ Komplexe etabliert und konnten die erste EM Struktur präsentieren. PilQ Komplexe bestehen aus einer Kegel- und Tassenstruktur und sechs gestapelten Ringen. Deletionsanalysen führten zur Identifizierung der sechs ringbildenden Domänen und Aufklärung ihrer Funktion bei der Transformation und Pilibildung. Nächstes Ziel ist die Identifizierung der minimalen Anzahl an Ringen für die Komplexassemblierung und Transformation. Der C-Terminus von PilQ schließt eine konservierte Domäne ein, die in vielen Sekretinen vorkommt und die Bindung an Pilotproteine vermittelt. Wir haben starke Hinweise, dass PilQ mit PilW interagiert. Diese Hypothese soll verifiziert und die Rolle des C-Teminus von PilQ bei der Interaktion geklärt werden. Eine bahnbrechende Entdeckung war die Detektion von Proteinen oberhalb der Kegel Struktur, die offensichtlich an der DNA Bindung beteiligt sind. Diese Proteine sollen identifiziert, charakterisiert und ihre Rolle bei der DNA Bindung analysiert werden. Kürzlich gelang uns in Kollaboration mit Vicki Gold (MPI für Biophysik, Frankfurt) die Darstellung der ersten in situ Struktur des PilQ-Komplexes durch Cryo-ET. Nächstes Ziel ist die Identifizierung der mit PilQ interagierenden Proteine in situ.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen