Structure, function and interaction partners of the traffic ATPase (PilF) and the secretin (PilQ) in a bacterial DNA transport machinery
Final Report Abstract
Im Rahmen des Forschungsprojektes wurden zwei zentrale Fragestellungen bearbeitet: 1. Struktur, Funktion und Interaktionspartner der ATPase PilF und 2. Struktur, Funktion und Interaktionspartner des Sekretinkomplexes des DNA-Transporters in "Thermus thermophilus". Die Hexamer-bildende Motor-ATPase PilF spielt eine essentielle duale Rolle bei der Aufnahme freier DNA und der Pilusassemblierung in T. thermophilus. PilF-ähnliche Motor-ATPasen sind in Proteinsekretionssystemen, DNA-Transportern und Pilussystemen weit verbreitet. PilF unterscheidet sich aber von allen bisher bekannten Motor-ATPasen durch einen ungewöhnlich langen N-Terminus, welcher drei konservierte MshEN-Domänen (Mannose-sensitiven Haemaglutinin Typ IV Pilus (T4P)) einschließt. Zur Bestimmung der Raumstruktur wurde versucht, das Gesamtprotein zu kristallisieren. Allerdings ohne Erfolg, nur vom C-Terminus ließen sich Kristalle herstellen. Das Problem konnte dann durch NMR-Spektroskopie in Kollaboration mit Prof. Jens Wöhnert (Goethe Universität Frankfurt) gelöst werden. Diese Analysen führten zu dem überraschenden Befund, dass zwei der konservierten MshEN-Domänen, MshEN-II und MshEN-III, den sekundären Botenstoff c-di-GMP mit unterschiedlicher Affinität binden. Die Deletion der MshEN-III-Domäne führte zu einer Hypertransformierbarkeit, während die Deletion der ersten zwei MshEN-Domänen die Beweglichkeit von T. thermophilus auf festen Oberflächen reduzierte. Die Bindung von c-di-GMP an die MshEN-II-Domäne führte somit zu einer Erhöhung der Flexibilität von PilF. Als Interaktionspartner von PilF wurde PilM identifiziert; PilM koppelt offensichtlich die Motor-ATPase mit der Assemblierungsplattform. Kryoelektronenmikroskopische Analysen in Kooperation mit Dr. Janet Vonck (MPI für Biophysik, Frankfurt) enthüllten die Struktur des PilQ-Komplexes auf atomarer Ebene. Insgesamt besteht der Komplex aus sechs aufeinanderliegenden Ringsystemen (N0 - N5), die in der Mitte einen Kanal bilden. Dieser Kanal ist durch zwei Eintrittspforten an den beiden Enden verschlossen. Oberhalb des PilQ-Komplexes wurde zum ersten Mal eine weitere Struktur, eine Krone, entdeckt, deren Natur unbekannt blieb. In PilQ wurden durch Mutantenstudien Aminosäuren erkannt, die offensichtlich für die Interaktion mit der Krone verantwortlich sind. Diese Mutanten waren nicht mehr transformierbar, was zu der Hypothese führte, dass die Krone für die DNA-Bindung/Aufnahme wichtig ist. Interaktionsstudien zeigten, dass PilQ mit PilW interagiert und darüber mit den Komponenten der Assemblierungsplattform (PilMNC). Über die Zielsetzungen des Antrages hinausgehend konnten durch Kryoelektronenmikroskopie in Kollaboration mit Prof. Vicki Gold (University of Exeter) erstmals zwei unterschiedliche Pilus-Strukturen auf der Oberfläche von T. thermophilus identifiziert werden. Mutantenstudien führten zur Aufklärung der Funktion dieser beiden Pilus-Typen und zur Identifizierung der Untereinheiten beider Pilus-Strukturen.
Publications
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(2017) Cryo-EM structure of the bifunctional secretin complex of Thermus thermophilus. eLife 6:e30483
D'Imprima, E., Salzer, R., Bhaskara R.M., Sánchez, R., Rose, I., Kirchner, L., Hummer, G., Kühlbrandt, W., Vonck, J. & Averhoff, B.
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(2018) Functional dissection of the three N-terminal general secretory pathway II domains and Walker motives of the traffic ATPase PilF from Thermus thermophilus. Extremophiles 22:461-471
Kruse, K., Salzer, R., Joos, F., Averhoff, B.
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(2019) The traffic ATPase PilF interacts with the inner membrane platform of the DNA translocator and type-IV pili from Thermus thermophilus. FEBS Open Bio. 9:4-17
Kruse, K., Salzer, R. & Averhoff, B.
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(2020) Cryo-electron microscopy reveals two distinct type-IV pili assembled by the same bacterium. Nat. Com. 11:2231
Neuhaus, A., Selvaraj , M., Salzer, R., Langer, J., Kruse, K., Kirchner, L., Sanders, K., Daum, B., Averhoff, B. & V. Gold
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(2021) Functional dissection of structural regions of the Thermus thermophilus competence protein PilW: Implication in secretin complex stability, natural transformation and pilus functions. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1863:183666
Yaman, D. & Averhoff, B.
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(2022) DNA binding by pilins and their interaction with the inner membrane platform of the DNA transporter in Thermus thermophilus. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1869:183818
Kirchner, L., Averhoff, B.
