Funktion und Struktur des RNA-degradierenden Exosoms im hyperthermophilen Archaeon Sulfolobus solfataricus
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das archaeale Exosom ist ein konservierter Proteinkomplex, welcher RNA exoribonucleolytisch in 3´-5´ Richtung abbaut. Dank seines phosphorolytischen Mechanismus ist es auch für die posttranskriptionelle Synthese von A-reichen, destabilisierenden Anhängen am 3´-Ende von Transkripten zuständig. Das archaeale Exosom besteht aus einem katalytisch aktiven Rrp41-Rrp42-Hexamer, auf welchem eine RNA-Bindekappe anliegt. In vitro können heterotrimere Kappen aus den Proteinen Rrp4 und Csl4 gebildet werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass die RNA-Bindekappe für die Interaktion mit RNA-Substraten wichtig ist, und dass Rrp4 (im Gegenteil zu Csl4) poly(A) Präferenz aufweist. Zusätzlich zu Rrp41, Rrp42, Rrp4 und Csl4, welche Orthologe von Untereinheiten des eukaryotischen Exosoms sind, besitzt das archaeale Exosom ein als DnaG (Primase des bakteriellen Typs) annotiertes Protein als weitere Untereinheit. Die Interaktionspartner von DnaG im Exosom und seine Funktion waren nicht klar. Andere Proteine wie Nop5, EF1-alpha und TIP49 wurden auch mit dem Exosom coimmunopräzipitiert. In frühere Studien wurde auch gezeigt, dass ein Großteil des archaealen Exosoms an der Peripherie der Zelle lokalisiert ist (das sog. unlösliche Exosom). Wir haben gezeigt, dass in vivo das archaeale Exosom heterotrimere Rrp4-Csl4 Kappen besitzt, mit mehr Csl4 im unlöslichen Exosom. Wir haben auch höhere DnaG Mengen im unlöslichen Exosom detektiert und gezeigt, dass DnaG mit Csl4 im Exosom interagiert. Weitere Analysen haben gezeigt, dass DnaG eine neue, konservierte RNA-Bindedomäne mit poly(A) Spezifität besitzt und den rRNA Abbau durch das Exosom in vitro erhöht. DnaG ist ein schwer lösliches Protein und deswegen konnten wir keine Proben des DnaG-Exosoms für SPEM Analysen gewinnen. Wir waren aber an einer Studie beteiligt (in Kooperation mit Prof. U. Bläsi aus Wien), welche zeigt, dass DnaG mit den archaealen Lsm Proteinen SmaP1/2 interagiert und hiermit die Level des löslichen (cytoplasmatischen) Exosoms und der polyadenylierten RNA in S. solfataricus beeinflusst. Zusammenfassend, haben unsere Arbeiten gezeigt, dass DnaG ein Teil der RNA-Bindeplatform des archaealen Exosoms ist und als Interaktionspartner von Faktoren fungiert, welche die Funktion oder die Aktivität des Exosoms modulieren. Wir haben auch die poly(A) Präferenz des Rrp4 Proteins analysiert und festgestellt, dass einzelne Aminosäuren in einer der RNA-Bindedomänen nicht dafür verantwortlich gemacht werden können. Wir haben auch festgestellt, dass die EF1-alpha und TIP49 Proteine nicht spezifisch an das Exosom binden. Eine spezifische Bindung an das Exosom wurde allerdings für Nop5 nachgewiesen. Nop5 interagiert mit Rrp4 im Exosom und erhöht die RNA Polyadenylierung in vitro. Hiermit ist Nop5 ein Teil der exosomalen RNA-Bindeplattform unter bestimmten Bedingungen. Nop5 ist bekannt als Teil eines RNA Methylierungskomplexes und scheint in der Stationärphase eine zusätzliche Funktion zusammen mit dem Exosom auszuüben. Um die Substrate des Exosoms in vivo zu detektieren, wurde eine iCLIP Analyse durchgeführt. Hiermit wurde die Binding des Exosoms an mRNAs, nicht kodierender und zirkulärer RNAs und posttranskriptionell angebrachter, Adenin-reicher RNA-Anhängen festgestellt. Die Crosslinkpositionen (welche die Bindung des Exosoms in vivo reflektieren) waren in nichtkodierenden RNAs weitgehend uniform verteilt waren. Im Gegensatz dazu wurde starkes Clustering um das Startcodon von mRNAs und in den ersten Gendezilen detektiert, welches deutlicher ausgeprägter war als das erwartete Clustering in der 3´-UTR. Das war überraschend und hat nahegelegt, dass während des exoribonucleolytischen Abbaus in 3´-5´ Richtung, das Exosom mit dem 5´-Ende der Transkripte interagiert. Dies könnte die Translation von Transkripten verhindern, welche einem Abbau zugeführt werden sollen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2012) Heterogeneous complexes of the RNA exosome of Sulfolobus solfataricus. Biochimie 94: 1578-1587
Witharana, C., Roppelt, V., Lochnit, G., Klug, G., Evguenieva-Hackenberg, E.
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(2013) Attack from both ends: mRNA degradation in the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus. Biochem. Soc. Trans. 41: 379-383
Evguenieva-Hackenberg, E., Bläsi, U.
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Evguenieva-Hackenberg, E. (2013) The archaeal DnaG protein needs Csl4 for binding to the exosome and enhances its interaction with adenine-rich RNA. RNA Biology 10: 415-424
Hou, L., Klug, G.
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(2014) Archaeal DnaG contains a conserved N-terminal RNA binding domain and enables polyadenylation of 16S rRNA by the exosome. Nucleic Acids Res. 42: 12691-12706
Hou, L., Klug, G., Evguenieva-Hackenberg, E.
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(2014) Structure and function of the archaeal exosome. WIREs RNA 5: 623-635
Evguenieva-Hackenberg, E., Hou, L., Glaeser, S. and Klug, G.
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(2017) Nop5 interacts with the archaeal RNA exosome. FEBS Letters 591:4039-4048
Gauernack, A.S., Lassek, C. , Hou, L., Dzieciolowski, J., Evguenieva-Hackenberg, E. and Klug G.
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(2017) The SmAP1/2 proteins of the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus interact with the exosome and stimulate A-rich tailing of transcripts. Nucleic Acids Res. 45: 7938-7949
Märtens, B., Hou, L., Amman, F., Wolfinger, M.T., Evguenieva-Hackenberg, E., Bläsi, U.
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(2018) The archaeal exosome: degradation and tailing at the 3’-end of RNA. In: RNA Metabolism and Gene Expression in Archaea. Clouet-d’Orval B Ed., Springer Nature
Evguenieva-Hackenberg, E., Gauernack, S. and Klug, G.
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(2020) Enzymatic analysis of reconstituted archaeal exosomes. Methods Mol.Biol. 2062:63-79
Evguenieva-Hackenberg, E., Gauernack, S.A., Hou, L. and Klug, G.
