Aufnahme und Speicherung von Bevacizumab in das retinale Pigmentepithel
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Therapeutische Antikörper werden in der Therapie retinaler Erkrankungen verstärkt intravitreal eingesetzt. Über ihre Interaktionen mit retinalen Zellen ist dagegen wenig bekannt. In diesem Projekt haben wir die Interaktion von Bevacizumab, einem anti-VEGF Antikörpers, der v.a. in der Therapie der altersabhängigen Makuladegeneration eingesetzt wird, mit dem retinalem Pigmentepithel, das eine Grenzschicht zwischen den Photorezeptoren und der Aderhaut bildet, untersucht. In vorrausgehenden Studien konnten wir zeigen, dass Bevacizumab in diese Zellen aufgenommen wird und sich in Zellen einlagert. Ziel dieses Projektes war, die Aufnahme und den intrazellulären Transportweg näher zu beleuchten. Dabei haben wir neben Bevacizumab auch den zur Behandlung von B- Zell Lymphomen verwendeten anti-CD20 Antikörpers Rituximab und das Fc-Fragment haltige anti-VEGF Fusionprotein Aflibercept genauer betrachtet. Wir konnten zeigen, dass die Aufnahme in das RPE nicht spezifisch für Bevacizumab ist, sondern mit identischer Kinetik und Aufnahmemuster auch für Rituximab und Aflibercept nachzuweisen ist. Die Aufnahme erfolgte dabei, wie für Bevacizumab gezeigt, teilweise über Clathrin-abhängige Endozytose; allerdings spielten auch passive Aufnahmemechanismen eine Rolle. Eine Beteiligung der Fcγ-Rezeptoren an der Aufnahme konnte ausgeschlossen werden, während der neonatale Fc-Rezeptor (FcRn) einen Einfluss auf das inrazellulär nachweisbare IgG zeigte. Die Aufnahme findet wahrscheinlich in Rab5-positive frühe Endosomen statt, in denen auch der neonatale Fc-Rezeptor (FcRn) nachgewiesen werden konnte. Interaktionen zwischen den FcRn mit den therapeutischen Molekülen sowie die Ansammlung von Bevacizmab auf der apikalen Seite unter FcRn Inhibition deuten auf eine Funktion von FcRn beim Recycling von Antikörpern im retinalen Pigmentepithel hin. Es konnte für Bevacizumab und Rituximab auch eine bidirektionale Transzytose durch das Epithel gezeigt werden. Intrazellulär ist Bevacizumab, sowie Rituximab und Aflibercept an Actinfilamenten nachzuweisen und die Daten deuten stark darauf hin, dass die therapeutischen Moleküle durch das Motorprotein Myosin7a transportiert wird. Interessanterweise waren auch Kolokalisationen zwischen Myosin7a und FcRn sichtbar. Für Bevacizumab konnte eine Sekretion in Exosomen nachgewiesen werden. Zusätzlich zeigte sich eine diffuse, die ganze Zelle betreffende Anreicherung von Bevacizumab in einigen Zellen, sowie eine Ansammlung von Bevacizumab in von Actinfilamenten umschlossenen Zisternen-artigen Strukturen. Die Daten aus dieser Arbeit ergeben, dass das retinale Pigmentepithel Immunoglobuline aktiv transportiert, was für die Pharmakokinetik von intravitrealen Antikörpern von Bedeutung sein kann. Die Spezifizität des Antikörpers spielt dabei keine Rolle. Im Rahmen diese Arbeit wurde ein interessantes Ergebnis erzielt, welches nicht Teil der originären Fragestellung war. Während Versuchen, die einige bereits in den Vorarbeiten zu diesem Projekt zuvor gewonnen Ergebnisse zur Beeinflussung der Aufnahme durch das Polysaccharid Fucoidan nach vollziehen und weiter ausarbeiten sollten, hatte eine Mitarbeiterin die Antikörper für den darauffolgenden Western Blot verwechselt, und so überraschend festgestellt, dass dieses eigentlich zur Aufnahmeinhibition eingesetzte Fucoidan die Expression von VEGF verhinderte. Hierzu wurden zusätzlich zu diesem Projekt noch weitere Daten gewonnen, auch in Kooperation mit Prof. Dr. Sabine Fuchs aus der Experimentellen Unfallchirugie des UK S-H, Campus Kiel, die zur Verleihung des Retina-Förderpreis 2014 der DOG führte.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Fucoidan but not Mannan inhibits Bevacizumab uptake independently of phagocytosis and reduces VEGF expression in the RPE. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2013; 54(15):5046
Dithmer M, Meyer T, Richert E, Roider J, Klettner A
- Time dependent intracellular pattern of Bevacizumab in RPE cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2013; 54(15):4629
Aboul Naga S, Dithmer M, Roider J, Klettner A
- Bevacizumab does not affect autophagy clearance during proteasomal inhibition in human retinal pigment epithelial cells. Journal of Biochemical and Pharmacological Research, 2014; Vol 2 (1): 44-53
Kivinen N, Dithmer M, Kinnunen K, Lucius R, Roider J, Kaarniranta K, Klettner A
- Intracellular pathways following uptake of bevacizumab in RPE cells. Exp Eye Res. 2015 Feb;131:29-41
Aboul Naga SH, Dithmer M, Chitadze G, Kabelitz D, Roider J, Klettner A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.exer.2014.12.010) - Intracellular uptake of therapeutic immunoglobulins and fusion proteins: Comparison between Aflibercept, Bevacizumab and Rituximab. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2015; 56(7):835
Dithmer M, Roider J, Klettner A
- The role of Fc-receptors in the uptake and transport of therapeutic antibodies in the retinal pigment epithelium. Exp Eye Research, Volume 145, April 2016, Pages 187-205
Dithmer M, Hattermann K, Pomarius P, Aboul Naga SH, Meyer T, Mentlein R, Roider J, Klettner A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.exer.2015.12.013)
