Variabilität pflanzlicher DSB-Reparatur während der Entwicklung und für die Genomgrößenevolution auf molekularer und chromosomaler Ebene

• Antragsteller: Professor Dr. Ingo Schubert
• Fachliche Zuordnung: Genetik und Genomik der Pflanzen ; Zell- und Entwicklungsbiologie der Pflanzen
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 214652223

DNA-Doppelstrangbrüche sind komplexe und potentiell letale DNA-Schäden. Demzufolge hat die Evolution mehrere Reparaturwege mit unterschiedlichen Ansprüchen an Sequenzhomologie und mit unterschiedlicher Reparaturgenauigkeit hervorgebracht. Im laufenden Projektzeitraum haben wir eine Strategie entwickelt, um mögliche Reparaturwege über eine Kombination aus Amplikonsequenzierung der Zielsequenzen und cytogenetischen Methoden zu erfassen. Überraschenderweise wurden in Gerste die meisten DSB während der S/G2-Phase des Zellzyklus über reziproken Austausch zwischen Schwesterchromatiden repariert. Erstmalig wurde auch ein effizientes, DSB-induziertes Gentargeting bei Gerste erzielt. Auf diesen Ergebnissen aufbauend, wurde ein Ansatz etabliert, um gleichzeitig verschiedene Varianten von NHEJ als auch von HR über unterschiedliche Ergebnisse (Wiederherstellung der Vorbruchsituation, Konversion, Deletion und/oder Insertion) auf der Zielsequenzebene zu erfassen. Mittels Hochdurchsatzsequenzierung (Pacbio) wollen wir potentielle Unterschiede hinsichtlich der Reparaturkapazität und der Reparaturwege in verschiedenen Entwicklungsstadien von A. thaliana und Gerste vergleichend untersuchen. Auf diesem Wege sollen mögliche Unterschiede bei der DSB-Reparatur zwischen großen und sehr kleinen Genomen aufgedeckt werden, die ggf. über einen Deletionsüberschuß in kleinen Genomen zu Genomschrumpfung führen. Darüberhinaus sollen die an Reportergenen erhaltenen Daten mit über CRISPR-Cas9-Nukleasen an endogenen Arabidopsis- und Gerste-Sequenzen (mit zu den Reportergenen ähnlicher Sequenzorganisation zum präferentiellen Nachweis von SSA bzw. SDSA) induzierter DSB-Reparatur verglichen werden. Der Effekt von CRISPR-Cas9-Nuklease-induzierten DSB und CRISPR-Cas-Nickase-induzerten SSB hinsichtlich der Wahl unterschiedlicher Repararurwege an gleichen Zielorten soll auf molekularer (Sequenzierung) und chromosomaler Ebene (SCEs, Chromosomen-aberrationen) untersucht werden. Im Rahmen dieses Ansatzes soll auch der Einfluß von DSB in homozygoten versus hemizygoten Zielsequenzen auf die Entstehung von (homologen) reziproken Translokationen geprüft, und der Anteil an Chromosomenumbauten, die vor bzw. nach der Replikation entstehen, erfasst werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen