Selbstreinigende Synthese von Peptidthioestern zum Aufbau von Proteindomänen auf Arrays und auf Beads
Final Report Abstract
In der Förderperiode konnte gezeigt werden, dass die selbstreinigende Synthese von Peptidthioestern einen schnellen und effizienten Zugang zu immobilisierten Protein-Domänen im Parallelformat eröffnet. Am Beispiel von SH3-Domänen aus Hefe und Mensch wurde gezeigt, dass die Proteine ihre Funktion beibehalten. Die Methode wurde für die parallele Funktionsanalyse phosphorylierter Proteindomänen eingesetzt. Im ersten Teil des Forschungsvorhabens wurde die Synthese von Peptidthioestern auf ihre praktische Anwendung hin getestet und eine Vielzahl benötigter Thioester nach einem optimierten Protokoll synthetisiert. Diese wurden für einen Cystein-Scan der SH3-Domäne von SHO1 des Hefeproteoms verwendet. Ein neu entwickelter Bindungsassay lieferte wichtige Information und zeigte, an welchen Positionen Cystein eingebaut werden muss, damit die chemische Synthese gelingt, ohne die Funktion der SH3-Domäne zu beeinträchtigen. Es wurde ferner gezeigt, dass die selbstreinigende Thioestersynthese automatisierbar ist. Die im Antrag erwähnten Arbeiten zur selbstreinigenden On-Bead-Ligation wurden in Angriff genommen. Nicht antizipierte Probleme stellten jedoch erhebliche Herausforderungen, so dass eine Neuausrichtung der Synthesestrategie geboten war. Die ersten Resultate der neuen Methode, die auf der selbstreinigenden Synthese von Peptidhydraziden basiert, sind vielversprechend. Es steht nun die Optimierung der Trägermaterialien an, die jedoch zu Gunsten eines neu aufgenommenen Projektkomplexes zurückgestellt wurde. Zusätzlich zu den im Antrag in Aussicht gestellten Arbeiten wurde die Methode einer breiteren Anwendbarkeit zugeführt. Hierzu wurde eine Immobilisierungschemie entwickelt, die Thioladditiven wiedersteht. Dadurch ist es möglich, thiolhaltigen Aminosäuren einzuführen und diese nach der nativen chemischen Ligierung in einer Radikalreaktion zu entschwefeln. Somit kann eine breite Palette von „cysteinfreien“ Verknüpfungsstellen erschlossen werden. Die neue Methode basiert auf der Immobilisierung von Peptidhydraziden über die Hydrazon-Konjugation. Die gebildeten Hydrazone können vor oder während der nativen chemischen Ligierung in stabile Peptidhydrazide überführt werden. Die Methode wurde anhand der Synthese von SH3-Domänen von YSC84 und ABP1 aus Hefe validiert. Dabei wurden die C21A-Mutante der YSC84-SH3-Domäne sowie die Pen34V-Mutante der ABP1-SH3-Domäne durchlaufen. Diese wurden durch Entschwefelung auf der Oberfläche von Mikrotiterplatten in die nativen Alanin- und Valin-Strukturen überführt. Bindungsmessungen und der Vergleich mit rekombinanten Proteinen belegten die biologische Aktivität der synthetischen Domänen. Die neu entwickelte Methode der Totalsynthese von SH3-Domänen auf Mikrotiterplatten wurde verwendet, um die Phosphoregulation humaner SH3-Domänen aufzuklären. Es wurden alle (d.h. 16) tyrosinphosphorylierte Varianten der SH3-Domänen von der Abl-Kinase und der Arg-Kinase auf der Oberfläche synthetisiert und die Bindung an 4 unterschiedliche Peptidliganden charakterisiert. Die Untersuchung zeigten, dass die Phosphorylierung nicht nur die Protein-Ligand-Interaktion abschwächen kann (wie bereits aus biochemischen und zellbiologischen Arbeiten gefolgert wurde), sondern überrascherweise die Interaktion auch verfestigen kann. Der Einfluss auf die Protein-Ligand-Interaktion hängt nicht nur vom Ort der Phosphorylierung an der SH3-Domäne ab, sondern auch vom Bindungspartner. Dadurch wird es möglich, die Präferenz der SH3- Domäne für bestimmte prolinreiche Bindungspartner durch Phosphorylierung zu steuern. Interessanterweise wird die Interaktion der Abl-SH3-Domäne mit einem prolinreichen Peptid, die in der Volllängen-Abl-Kinase in cis stattfindet und diese damit in einem inaktiven Zustand hält, durch Phosphorylierung aufgehoben. Dieselbe Phosphorylierung erhöht allerdings die Affinität der Abl-SH3-Domäne für ein Peptid, das aus dem Adapterprotein 3BP1 entnommen wurde. Die Arbeiten an den totalsynthetischen Proteindomänen weisen darauf hin, dass die Phosphorylierung der SH3-Domänen genutzt werden könnte, um das Protein-Protein- Interaktionsnetzwerk in einer Zelle neu zu „verdrahten“.
Publications
- "Automated Fmoc-based solid-phase synthesis of peptide thioesters with self-purification effect and application in the construction of immobilized SH3 domains", J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 11110-11118
F. Mende, M. Beisswenger, O. Seitz
- "9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-basierte Festphasensynthese von α-Peptidthioestern", Angew. Chem. 2011, 123, 1266-1274; Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 1232-1240
F. Mende, O. Seitz
