Automatisiertes, mikroskopiebasiertes Analysesystem für IF und IHC
Final Report Abstract
Das bildgebende Verfahren ermöglicht eine präzise Phänotypisierung von Einzelzellen in Gewebeschnitten und Zellkulturen. Die Aufnahme der Einzelbilder erfolgt automatisiert. Je nach Fragestellung können diverse Zielstrukturen innerhalb einer definierten Zellpopulation durch spezifische Antikörper bzw. Färbemethoden visualisiert werden. Die Analyse der daraus resultierenden Signale erfolgt über spezifische Softwarepakete. Die Stärke des Systems liegt darin, dass die Signalintensitäten, respektive die Menge der zu analysierenden Zielstrukturen, detektiert und graphisch dargestellt werden können. Dies ist dann von Vorteil, wenn Zelltypen nur durch die Expressionsstärken diverser Marker zu unterschieden sind. Zusätzlich kann die Lokalisation einer definierten Zellpopulation mit den Eigenschaften „x, y und z“ im Gewebe erfolgen. Die Technik ist am Standort in die Studentenausbildung integriert und wurde bei folgenden Projekten angewendet: Infektionsimmunologie: Analyse der B-Zellantwort in den drainierenden Lymphknoten der Haut nach Infektion mit Leishmania (L.) major. Durch das bildgebende Verfahren konnten B-Zellen in situ anhand der Immunglobulinmenge charakterisiert und quantifiziert werden. Somit konnte die Bedeutung von Langerhanszellen für die B-Zellantwort im drainierenden Lymphknoten dargestellt werden. - Quantifizierung myeloider Zellsubtypen in Läsionen L. major-infizierter Versuchstiere. Die Expressionsstärken von Lymphozytenantigenen auf myeloiden Zellen wurde bestimmt. Diverse Subpopulationen infizierter myeloider Zellen konnten in situ dargestellt und quantifiziert werden, mit folgendem Ergebnis: die Funktionalität von myeloiden Zellen ist mausstammspezifisch. - Phänotypisierung infizierter Wirtszellen in situ und in vivo. Im Bereich der Infektionsimmunologie ist es von großer Bedeutung, die Parasitenlast und den Phänotyp der Wirtszellen simultan bestimmen zu können. Mit Hilfe des bildgebenden Verfahrens wurde ein Algorithmus entwickelt, der Parasiten in den Wirtszellen zuverlässig detektiert. In Kombination mit zusätzlichen immunfluoreszenzbasierten Techniken gelang zudem die Darstellung des Phänotyps der infizierten Wirtszellen in Abhängigkeit der Parasitenlast. Experimentelle Orthopädie: Charakterisierung der Osteoklastenaktivität in vitro. Durch geeignete in vitro-Modelle kann die Aktivität von Osteoklasten „bestimmt werden. Knochenmark-Makrophagen von Dark Agouti-Ratten wurden zu unterschiedlichen Krankheitsstadien einer Kollagen-II-induzierten Arthritis isoliert und zu Osteoklasten differenziert. Anschließend wurde die Resorptionskapazität der Osteoklasten in Anwesenheit verschiedener sympathischer Neurotransmitter analysiert. Es konnten keine Unterschiede bezüglich der Aktivität von Osteoklasten aus gesunden und arthritischen Ratten gemessen werden. Die Stimulation mit Acetylcholin bewirkte eine Steigerung der Resorptionsaktivität von Osteoklasten aus chronisch arthritischen Ratten. Das bildgebende Verfahren ermöglichte die Hochdurchsatz-Bilderfassung von Mikrotiterplatten. - Charakterisierung der Osteoklastendifferenzierung in vitro. Die Differenzierung von Knochenmark-Makrophagen von C57BL/6J, Tac1-/- und sympathekomierten Mäusen zu reifen Osteoklasten erfolgte bei unterschiedlichen Bedingungen. Das bildgebende Verfahren ermöglichte eine automatisierte Bilderfassung der Mikrotiterplatten. Die Übersichtsbilder der einzelnen Kulturansätze wurden verwendet, um die Anzahl der jeweils reifen (Tartrat-resistente saure Phosphatase+) Osteoklasten zu quantifizieren. Es konnten keine signifikanten Unterschiede in der Differenzierungskapazität von Knochenmark-Makrophagen aus Tac1-/- und sympathektomierten Mäusen zu reifen Osteoklasten im Vergleich zu den C57BL/6J-Kontrollen festgestellt werden. Neuro-Endokrino-Immunologie: Darstellung von Neurotransmittern in entzündlichen Geweben. Im Rahmen des Schwerpunktprogramms „Immunobone“ wurde die Expression catecholaminerger und cholinerger Marker im peripheren Nervensystem im Verlauf einer experimentellen Arthritis, im Synovialgewebe von Patienten mit rheumatoider Arthritis bzw. Osteoarthrose, und in vitro in einem Kokultur-Modell von Nervenzellen mit Arthritis-relevanten Immunzellen untersucht. Speziell für die erfolgreiche Etablierung einer Immunfluoreszenz-Doppelfärbung für die gleichzeitige Quantifizierung der Expression catecholaminerger und cholinerger Marker in peripheren Nervenzellen des Kokulturmodells konnte das bildgebende Verfahren einen wichtigen Beitrag zur Validierung der Methode leisten. So konnte in anschließenden Versuchen gezeigt werden, dass periphere Nervenzellen in Kokultur mit Osteoklastenvorläuferzellen, welche aus gesunden Kontrolltieren gewonnen wurden, eine erhöhte Expression cholinerger Nervenfasern aufweisen als Vergleichsexperimente, bei welchen die Osteoklastenvorläuferzellen aus arthritischen Tieren gewonnen wurden.
Publications
- iedermair, T. et al. Absence of substance P and the sympathetic nervous system impact on bone structure and chondrocyte differentiation in an adult model of endochondral ossification. Matrix Biol 38, 22-35 (2014)
Niedermair, T. et al.
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Schmid, M., Zimara, N., Wege, A.K. & Ritter, U.
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(See online at https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139866) - Catecholaminergic-tocholinergic transition of sympathetic nerve fibers is stimulated under healthy but not under inflammatory arthritic conditions. Brain Behav Immun 46, 180-191 (2015)
Stangl, H., Springorum, H.R., Muschter, D., Grassel, S. & Straub, R.H.
(See online at https://doi.org/10.1016/j.bbi.2015.02.022) - Sympathetic Neurotransmitters Modulate Osteoclastogenesis and Osteoclast Activity in the Context of Collagen-Induced Arthritis. PLoS One 10, e0139726 (2015)
Muschter, D., Schafer, N., Stangl, H., Straub, R.H. & Grassel, S.
(See online at https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139726)
