Computergestütztes Moleküldesign für DNA-Motive für Anwendungen in der DNA-basierten Selbstorganisation und den Nanostrukturwissenschaften
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die in silico Arbeiten im Rahmen dieses Projekts wurden erfolgreich abgeschlossen. Der DNA-Sequence-Compiler dsc wurde gemäß der Beschreibung der Arbeitspakete im Antrag erweitert. Die Experimente zeigten, dass die theoretischen Überlegungen, die Erweiterungen wie Parallelisierung der Sequenzsuche oder Toleranz von Fehlem bei der Suche motivierten, tatsächlich zutreffend waren. So erhöhte in vielen Fällen die Parallelisierung die Erfolgswahrscheinlichkeit der Sequenzsuche. Allerdings ließ sich dies ebenso wenig auf alle Fälle verallgemeinem wie Vorhersagen bzgl. der Auswirkung einer bestimmten Wahrscheinlichkeit, mit der Fehler toleriert werden, auf die tatsächlichen Erfolgs- und Fehlerraten. Insgesamt bleibt es stark vom konkreten Anwendungsfall abhängig, ob diese Maßnahmen sich tatsächlich positiv auswirken, und wenn ja in welchem Ausmaß. Weiterhin wurden im Hinblick auf die Anwendung in Evolutionären Algorithmen mehrere Sequenzdistanzmaße daraufhin untersucht, wie gut sie die Neigung zu Hybridisierungen von DNA-Molekülen modellieren können. Die allermeisten Maße korrelieren stark mit der tatsächlichen Hybridisierungsneigung, gemessen an der freien Enthalpie, wenn man die ganze Breite möglicher Bewertungen in Betracht zieht. Reine Zufallssequenzen bekommen extrem häufig Bewertungen im Mittelfeld sowohl der Distanzmaße als auch der freien Enthalpie. Wirklich schlechte Sequenzmengen scheinen eher selten zu sein. Einige für dieses Projekt entwickelte Maße, wie Varianten von Maßen, die auf der Lempel-Ziv-Komplexität basieren, und die z.B. nur Einträge einer bestimmten Mindestlänge ins Wörterbuch aufnehmen, oder die nicht nur die Komplexität einer Sequenz sondem einer Sequenzmenge betrachten, brachten keine weiteren Vorteile gegenüber bekannten Maßen. Die starke Kausalität der Unähnlichkeitsmaße, gemessen als Autokorrelationslänge einer Reihe von Mutationsschritten durch den Suchraum, ist für sämtliche untersuchten Maße kaum vorhanden. Dies spricht zunächst eher gegen den Einsatz dieser Maße als Fitnessfunktion in einem Evolutionären Algorithmus (EA). Immerhin ist ein solcher EA in der Lage, Sequenzmengen mit hoher Ähnlichkeit unter den enthaltenen Sequenzen auf das Niveau von Zufallsmengen zu verbessem, und für viele Maße auch ein Stück darüber hinaus. Auch diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass vermutlich der bei weitem größte Tei! des Suchraums aus passablen Sequenzmengen besteht (wenn man nur die Sequenzunähnlichkeit betrachtet und andere Anforderungen an die Moleküle ignoriert), und es nur einen sehr kleinen Anteil an ungeeigneten Sequenzmengen gibt, die z.B. mittels eines EA leicht repariert werden können. Somit ist das DNA-Sequenzdesign anscheinend weniger eine Suche nach herausragend guten Sequenzmengen, sondem eher eine Vermeidung von herausragend schlechten. Bezüglich multikriterieller EA hat sich u.a. herausgestellt, dass einige der Anforderungen an die Sequenzmengen wie eine möglichst geringe Streuung von Schmelztemperatur oder GC-Gehalt der Moleküle als eigene Kriterien eher ungeeignet sind, da sie zu leicht das für sie globale Optimum erreichen und die Paretofront dadurch zu einem Punkt kollabiert. Es scheint sinnvoller zu sein, solche Anforderungen als Beschränkungen zu formulieren, die dann z.B. mit Hilfe einer restricted tournament selection behandelt werden. Auch die in vitro Zielprojekte konnten weitgehend erfolgreich umgesetzt werden. Es konnten Nanoarrays aus drei verschiedenen strukturellen DNA-Bausteinen entworfen, hergestellt und charakterisiert werden. Zwei Methoden zur Messung der Effizienz des Self-Assemblies für einen Entwurf wurden entwickelt und anhand beispielhafter Nanoarrays demonstriert, konnten aber nicht mehr systematisch auf viele verschiedene Arrays angewendet werden. Die Funktionalisierung der 4x4-Arrays durch Hinzufügen von einzelsträngigen Fängeroligonucleotiden führte zur Destabilisierung der Bausteine und verhinderten deren effiziente Assemblierung zu Nanoarrays. Zumindest für eine Bausteinvariante konnten kleine Arrays hergestellt und ihre Funktionalisierung mittels Immobilisierung von DNA-Streptavidin-Konjugaten nachgewiesen werden. Es sind eine Reihe von Weiterentwicklungen der bestehenden DNA-Sequenzdesignsoftware denkbar, die auf in diesem Projekt gewonnenen Erkenntnissen beruhen. Zum Beispiel würde die Möglichkeit zur Vorgabe der Reihenfolge, in der die Sequenzen generiert werden, die Chancen für eine erfolgreiche Suche erhöhen. Auch wäre bei den Fehlertoleranzmethoden eine genauere Kontrolle darüber, wo die Fehler gemacht werden, wünschenswert. Die Untersuchungen zu multikriteriellen Evolutionären Algorithmen zur Sequenzsuche sollten im Licht der hier gewonnenen Erkenntnisse vertieft werden. Insbesondere die anscheinend konfliktären Zielfunktionen, die ursprünglich dasselbe biochemische Phänomen der DNA-Hybridisierung modellieren, sollten genauer untersucht werden. Die im Rahmen dieses Projekts entworfenen und realisierten in vitro Zielprojekte werden zukünftig in der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Niemeyer weiterentwickelt und verwendet. So werden einige der ursprünglich geplanten Ziele, die aufgrund oben erwähnter Schwierigkeiten nicht im Rahmen dieses Projekt vollständig realisiert werden konnten, nach Ablauf dieses Projekts in der Arbeitsgruppe weiter verfolgt. Dazu gehören z.B. die Funktionalisierung von Nanoarrays mit unterschiedlich adressierbaren Funktionseinheiten für Multiplexing-Anwendungen und die reversible DNA-gelenkte Immobilisierung von Proteinen und Nanopartikeln auf Nanoarrays. Darüber hinaus werden weitere strukturelle Motive untersucht werden, die mit der in diesem Projekt weiterentwickelten Software entworfen werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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High-Throughput, Real-Time Monitoring of the Self-Assembly of DNA Nanostructures by FRET Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition, 2008, 47, 2135-2137
Saccà, B.; Meyer, R.; Feldkamp, U.; Schroeder, H. & Niemeyer, C.M.
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Rational Engineering of Dynamic DNA Systems. Angewandte Chemie International Edition, 2008, 47, 3871-3873
Feldkamp, U. & Niemeyer, C.M.
