MALDI TOF MS/MS Massenspektrometer
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Massenspektroskopie wurde im Wesentlichen durchgeführt, um Proteine nach einer Isolierung zu identifizieren und um Modifikationen von Proteinen und Peptiden in vitro und in vivo nachzuweisen. Beispiele der Projekte sind im Folgenden aufgeführt: i) Um Proteine nach SDS Gelelektrophorese und tryptischem Verdau der Proteinbande zu identifizieren. Dies hat z.B. zur Klonierung einer ungewöhnlich sauerstoffstabilen Hydrogenase aus Citrobacter geführt, die zukünftig biotechnologische Anwendungen haben könnte. In diesem Projekt wurde das Enzym biochemisch aus Citrobacter Lysaten aufgereinigt und mittels Massenspektroskpie identifiziert. Anschließend konnte es kloniert und rekombinant in E. coli in größeren Mengen exprimiert werden. In einem anderen Projekt wurde MALDI eingesetzt, um den Häm Typ von isolierten Enzymen zu bestimmen (Unterscheidung von b-Typ und c-Typ Cytochromen. ii) Um enzymatische Methylierung von Peptiden nachzuweisen. Eine Gruppe von Methyltransferasen überträgt Methylgruppen auf Lysinreste u.a. in Histone, die dort wichtige Rollen in der Regulation von Chromatin spielen. Mittels Massenspektorskopie konnte gezeigt werden, dass eine in Tumoren gefundene Mutation des MLL3 Enzyms die Produktspezifität des Enzyms verändert. Während das wildtyp Enzym nur eine Methylgruppe auf sein Ziellysine überträgt, katalysiert die Mutante eine Trimethylierung des Lysin, was die biologische Wirkung der Modifikation wesentlich verändert. iii) Um enzymatische Modifikationen von Proteinen in vitro nachzuweisen. Dies hat z.B. zur Identifizierung einer CKII abhängige Phosphorylierungsstelle der DNMT3A DNA Methyltransferase geführt. Es konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung die Aktivität und Lokalisation des Enzyme reguliert und dies eine wichtige Rolle bei der Krebsenstehung spielen kann. Massenspektroskopie war essentiell um die genaue Phosphorylierungsstelle von CKII an DNMT3A in vitro nachzuweisen. In einem anderen Projekt wurde eine Beobachtung in der Literatur, das nämlich die SET8 Protein Lysin Methyltransferase ein NUMB genanntes Protein methyliert, näher untersucht. Mittels Massenspektroskopie (und anderer analytischer Verfahren) konnte jedoch gezeigt werden, dass diese Aktivität nicht auftritt und darauf aufbauende weitergehende Hypothesen mit Vorsicht interpretiert werden sollten. iv) Um die enzymatische Modifikationen von Proteinen in Zellen nachzuweisen. In einem Projekt wurden neue Proteinsubstrate der NSD1 Protein Lysin Methyltransferase gesucht. Arbeiten mit Peptiden (die ebenfalls massenspektroskopisch durchgeführt wurden) haben zu der Beobachtung geführt, dass dieses Enzym das Histon H1.5 Protein methylieren kann. Um diese Aktivität auch in Zellen nachzuweisen, wurden beide Proteine in humanen Zellen experimiert, das Histon H1.5 Protein isoliert und anschließend mittels Massenspektrokopie die Methylierung dieses Proteins nachgewiesen. Im Rahmen der laufenden Forschungsarbeiten in der Polymerchemie wurden lineare und verzweigte Polythiophene mit Hilfe der MALDI-Spektroskopie vermessen. Diese über eine Kumada-Kupplung hergestellten Polymere wurden hinsichtlich der Endgruppen sowie im Falle der Copolymerisationen auf deren kovalente Verknüpfung der verschiedenen Co-Monomere untersucht. Darüber hinaus war es möglich die Einbauverhältnisse der Co-Monomeren zu bestimmen. In einem weiteren Projekt aus der Organischen Chemie wurden besonders lange Oligonukleotide (ca. 100 Nukleotide) vermessen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 2012;94(11):2212-8
Kudithipudi S, Dhayalan A, Kebede AF, Jeltsch A
- Electropolymerized Three-Dimensional Randomly Branched EDOT- Containing Copolymers. Langmuir, 2013 29 (49), 15463–15473
Link SM, Scheuble M, Goll M, Muks E, Ruff A, Hoffmann A, Richter TV, Lopez-Navarrete JT, Ruiz- Delgado MC and Ludwigs S
- Non-radioactive Protein Lysine Methyltransferase Microplate Assay Based on Reading Domains. ChemMedChem 2013 9(3):554-9
Kudithipudi S, Kusevic D, Jeltsch A
- Branched polythiophenes by Ni-catalyzed Kumada coupling. Polym. Chem. 2014 (5), 6824-6833
Scheuble M, Richter TV, Goll M, Link S, López- Navarrete JT, Ruff A, Ruiz-Delgado MC, Ludwigs S
(Siehe online unter https://doi.org/10.1039/C4PY00899E) - Regulation of DNA Methylation Patterns by CK2-Mediated Phosphorylation of Dnmt3a. Cell Reports 2014 8(3):743-53
Deplus R, Blanchon L, Rajavelu A, Boukaba A, Defrance M, Luciani J, Rothé F, Dedeurwaerder S, Denis H, Brinkman AB, Simmer F, Müller F, Bertin B, Berdasco M, Putmans P, Calonne E, Litchfield DW, de Launoit Y, Jurkowski TP, Stunnenberg HG, Bock C, Sotiriou C, Fraga MF, Esteller M, Jeltsch A & Fuks F
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.celrep.2014.06.048) - Substrate Specificity Analysis and Novel Substrates of the Protein Lysine Methyltransferase NSD1. Chemistry & Biology 2014 21(2):226-37
Kudithipudi S, Lungu C, Rathert P, Happel N & Jeltsch A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2013.10.016) - Activity and specificity of the human SUV39H2 protein lysine methyltransferase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms, 2015 1849(1):55-63
Schuhmacher MK, Kudithipudi S, Kusevic D, Weirich S, & Jeltsch A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2014.11.005) - Identification, cloning and heterologous expression of active [NiFe]-hydrogenase 2 from Citrobacter sp. SG in Escherichia coli. J. Biotech. 2015 199, 1-8
Maier JAH, Ragozin S, Jeltsch A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2015.01.025) - Investigation of the methylation of Numb by the SET8 protein lysine methyltransferase. Sci Rep. 2015 5:13813
Weirich S, Kusevic D, Kudithipudi S, Jeltsch A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/srep13813) - Somatic cancer mutations in the MLL3-SET domain alter the catalytic properties of the enzyme. Clin. Epigenetics 2015 7(1), 36
Weirich S, Kudithipudi S, Kycia I, Jeltsch A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1186/s13148-015-0075-3)
