Stoichiometry of the AMPA receptor´s assembly with regulatory membrane proteins
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Ziele des Antrags wurden teilweise erreicht. Ursprünglich war geplant, die Experimente auf Einzelmolekül-Level in Xenopus laevis Oozyten und in Neuron-Lysaten durchzuführen, und auch Hirnschnitte von Tieren immunohistochemisch zu untersuchen. Allerdings wurden die Experimente in Neuronen und mit Tierpräparaten nicht durchgeführt, da diese unter den gegebenen Bedingungen zu anspruchsvoll gewesen wären. Drei Themengebiete wurden behandelt: 1. Der Zusammenbau von heteromeren AMPA-Rezeptoren bestehend aus GluA1 und GluA2, insbesodere die Fragestellung, ob eine bestimmte Stöchiometrie bevorzugt wird. 2. Wettbewerb von verschiedenen regulatorischen AMPA-Rezeptor-Untereinheiten um Bindungsstellen am Rezeptor. 3. Vorkommen von Komplexen aus CNIHs und AMPA-Rezeptoren an der Plasma-Membran und Anzahl der and den Rezeptor-Kern gebundenen CNIHs. Alle drei Themengebiete konnten erfolgreich behandelt werden: 1. GluA1 wurde mit GFP und GluA2 mit einem roten FP gelabelt und ko-exprimiert. Mit Hilfe von Einzelmolekül-Imaging konnten wir einen von uns vorher entwickelten Ansatz weiterverfolgen, um in einer gemischten Population aus verschiedenen Heteromeren die relativen Häufigkeiten jeder Stöchiometrie zu bestimmen. Wir konnten zeigen, dass die 2:2 Stöchiometrie präferiert wird, und die 1:3 und 3:1 Stöchiometrien unterdrückt sind. 2. Eine neue Entwicklung für diese Fragestellung ist Einzelmolekül-Imaging in 3 Farben, das für quantitative Messungen mit Zählung der Moleküle bzw. Untereinheiten bisher noch nie verwendet wurde. Damit konnten wir den Rezeptor-Kern und die zwei regulatorischen Untereinheiten γ-2 und GSG1L fluoreszent markieren und deren Wettbewerb um Bindungsstellen am Rezeptor quantifizieren. Wir fanden, dass die Bindungsstärke in etwa gleich ist. 3. Die regulatorische Untereinheit CNIH2 konnten wir durch testen verschiedener Linker und Positionen in den intrazellulären Loops fluorezenzmarkieren. Wir fanden heraus, dass CNIH2 mit dem AMPA-Rezeptor-Kern an der Plasma-Membran direkt interagiert und vier CNIH2 Bindungsstellen bestehen. Manuskripte zu den drei Themen sind in Vorbereitung.
