Laserscanning-Mikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Haupteinsatz des Laserscanning-Mikroskops (LSM) ist eine Methode zum Nachweis einzelner Proteinaggregate auf Glasoberflächen (surface-based fluorescence intensity distribution analysis, sFIDA), die am hiesigen Institut zur Diagnose von Prionenerkrankungen entwickelt wurde. Prionenerkrankungen umfassen Creutzfeldt-Jakob, Scrapie oder BSE und stellen quasi den Prototyp von sog. Proteinfehlfaltungs-Krankheiten dar, zu denen heute auch Neurodegenerationen vom Typ Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson gezählt werden. Charakteristischerweise kommt es im Verlauf der Pathogenese zur Bildung von Aggregaten aus bestimmten körpereigenen, feilgehaltenen Proteinen. Diese sind ein vielversprechender Biomarker für eine frühzeitige Diagnose des Krankheitsbilds. Beim sFIDA-Assay wird zunächst eine Glasoberfläche dahingehend funktionalisiert, dass Fänger-Antikörper kovalent immobilisiert werden können. Anschließend erfolgt die Bindung der Proteinaggregate an diese Antikörper. Die Aggregate werden nun mit Detektionssonden beladen. Dies sind üblicherweise zwei verschiedene Antikörper, die mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind. Bei Wahl von überlappenden Epitopen, kann monomeres Protein nur von einer einzelnen Sonde besetzt werden. Der Nachweis der Aggregate erfolgt mittels konfokaler Laser Scanning Technologie, indem die Glasoberfläche von einem zweifarbigen Laserfocus gescannt wird. Es werden nur die Signale bewertet, die simultan in beiden Detektionskanälen registriert werden (Colokalisation). Das im Rahmen dieser Förderung angeschaffte LSM bietet alle technischen Voraussetzungen, die notwendig sind, um auch einzelne Proteinpartikel zu detektieren. Es ist u.a. mit hoch sensitiven HyD- Detektoren ausgestattet. Diese hohe Nachweisempfindlichkeit ist von äußerster Wichtigkeit, da die Aggregatkonzentration in natürlichen Proben, wie Körperflüssigkeiten gering ist. Im Berichtszeitraum war das LSM stark ausgelastet. Als äußerst nützlich erwies sich die hohe Automatisierbarkeit des Mikroskops. So können zahlreiche Proben im Multiwellformat vermessen werden, wobei der Autofocus (AFC) dabei sehr verlässlich funktionierte. Die FCS-Funktion des Geräts wurde insbesondere bei der Qualitätsanalyse von fluoreszenzmarkierten Antikörpern verwendet. Das LSM kam ferner in diversen Praktika des Instituts zum Einsatz. 2015 wurde das Gerät aus Drittmitteln mit einem Instrument aufgerüstet, um Aggregationsprozesse in Membranumgebung visuell und elektrophysiologisch verfolgen zu können. Das LSM hat wesentlich dazu beigetragen, die sFIDA-Technologie im Rahmen von Bachelor-, Master- und Doktorarbeiten weiterzuentwickeln und zu validieren. Wir konnten erfolgreich demonstrieren, dass das automatisierte LSM für die Biomarker-basierte Routinediagnostik von neurodegenerativen Erkrankungen geeignet ist. Die Nutzung des Gerätes hat wesentlich zur erfolgreichen Publikation verschiedener Projektergebnisse und zur erfolgreichen Bewilligung weiterer Drittmittelanträge beigetragen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2012) Detection of alpha-synuclein aggregates by fluorescence microscopy. Rejuvenation Res 15, 213-216
Hübinger S, Bannach O, Funke SA, Willbold D, Birkmann E
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(2013) Seeded fibrillation as molecular basis of the species barrier in human prion diseases. PLoS One 8, e72623
Luers L, Bannach O, Stöhr J, Wördehoff MM, Wolff M, Nagel-Steger L, Riesner D, Willbold D, Birkmann E
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(2013) The amyloid-β oligomer count in cerebrospinal fluid is a biomarker for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis 34, 985-994
Wang-Dietrich L, Funke SA, Kühbach K, Wang K, Besmehn A, Willbold S, Cinar Y, Bannach O, Birkmann E, Willbold D
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(2015) Single fibril growth kinetics of α-synuclein. J Mol Biol 427, 1428-1435
Wördehoff MM, Bannach O, Shaykhalishahi H, Kulawik A, Schiefer S, Willbold D, Hoyer W, Birkmann E
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Bannac Contact between the β1 and β2 Segments of α-Synuclein that Inhibits Amyloid Formation. Ang Chem, Angew. Chem. Int. Ed. 54, 8837-8840
Shaykhalishahi H, Gauhar A, Wördehoff MM, Grüning CS, Klein AN
