Hochauflösendes Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Seit Inbetriebnahme des Feldemissions-Rasterelektronenmikroskops am 15. Oktober 2012 sind 12 Manuskripte publiziert worden, in denen die mit dem REM erzielten Daten enthalten sind und z.T. von zentraler Bedeutung für die Publikation waren. Nora Müller und Sibylle Schneider-Schaulies (Institut für Virologie und Immunologie, Universität Würzburg) untersuchten den Einfluss der neutralen Sphingomyelinase (NSM) auf die physiologische Aktivierung von T-Zellen. Aktivierte T-Zellen breiteten sich aus und bildeten großflächige Lamellopodien. Diese auffälligen morphologischen Veränderungen, die durch die Expression von NSM gehemmt wurde, wurden durch Rasterelektronenmikroskopie (REM) dokumentiert. REM wurde ebenfalls eingesetzt, um die komplexe Oberflächenstruktur von verschiedenen Linien von Glioblastoma Tumorzellen zu analysieren, die sich im Expressionsniveau der Tumormarker p53 und PTEN unterschieden (Arbeitsgruppe Cholpon S. Djuzenova; Universitätsklinik Würzburg). In der Arbeitsgruppe von Lorenz Meinel (Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie, Universität Würzburg) werden Matrices aus biologisch abbaubaren Kunststoffen (Seidenfibroin, Poly-ɛ-Caprolacton) hergestellt, in die während der Produktion gezielt Wirkstoffe eingelagert werden. Je nach den gewählten Bedingungen entstehen Matrices mit Fasern unterschiedlicher Dicke und Oberflächenstruktur. REM war eine der zentralen Methoden für die Analyse der hergestellten Matrices vor und nach der Freisetzung der Wirkstoffe in physiologischen Puffern. Am Lehrstuhl für Ökophysiologie und Vegetationsbiologie (Botanik II); wurde und wird das REM routinemäßig für die Darstellung der Oberflächen von Pflanzengeweben und von Gewebsquerschnitten als Kontrollmethode eingesetzt. Brigitte Fiala (Lehrstuhl für Tierökologie und Tropenbiologie, Universität Würzburg) setzte das REM ein, um Spezies von Fransenflügler (Thysanoptera) eindeutig mit Hilfe von artspezifischen Thorax Differenzierungen identifizieren zu können. Otolithen - Gehörsteine im Innenohr höherer Fische - bestehen aus Calciumcarbonat und einem geringen Anteil an organischer Substanz (u.a. Proteine). Im Zebrafisch wird die Calcium Ablagerung in den Otolithen durch das Protein „starmaker“ gesteuert. In einer Zusammenarbeit der Elektronenmikroskopie (Universität Würzburg) mit der Universität von Wroclaw (Polen) wurde u.a. die in vitro Bildung von Calciumcarbonat Kristallen in Abhängigkeit des „starmaker“- ähnlichen Proteins aus dem Reiskärpfling (Medaka, Oryzias latipes) untersucht. Es konnte eindeutig durch REM Untersuchungen gezeigt werden, dass das Protein die Kristallbildung beeinflusst. Mit steigender Proteinkonzentration im Kristallisationsmedium wurden vermehrt abgerundete Kristalle gebildet. In einer Kooperation der Abteilung Elektronenmikroskopie und des Lehrstuhls für Biotechnologie und Biophysik (beide Universität Würzburg), einer Arbeitsgruppe aus Canada und einer aus Frankreich wurden Methoden für die korrelative hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie (dSTORM: direct stochastic optical reconstruction microscopy; SIM: structured illumination microscopy) und Rasterelektronenmikroskopie etabliert. Dazu wurden native isolierte Zellstrukturen (Kernhüllen von Oocyten der Krallenkröte) oder Ultradünnschnitte von 100 nm Dicke des Nematoden C. elegans auf Deckgläschen oder Objektträger übertragen. Nach der fluoreszenzmikroskopischen Analyse wurden anschließend die gleichen Stellen im REM analysiert. Die Rekonstruktion der dSTORM bzw. SIM Bilder mit den REM Aufnahmen zeigte, dass jedes Fluoreszenzsignal mit hoher Präzision einer distinkten Substruktur eines Kernporenkomplexes bzw. Gap- Junctions, Mikrotubuli oder Heterochromatin zugeordnet werden konnte. Die Untersuchungen ermöglichten erstmals die verlässliche ultrastrukturelle Identifikation von Gap-Junctions im Nervensystem von C. elegans. Zusätzlich konnte erstmals ihre dreidimensionale Anordnung in bestimmten Nervenzellen durch die Auswertung von seriellen Ultradünnschnitten dargestellt werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2014). Cell surface area and membrane folding in glioblastoma cell lines differing in PTEN and p53 status. PLoS One 9(1):e87052
Memmel S, Sukhorukov VL, Höring M, Westerling K, Fiedler V, Katzer A, Krohne G, Flentje M, Djuzenova CS
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Controlled Protein Delivery from Electrospun Non-Wovens: Novel Combination of Protein Crystals and a Biodegradable Release Matrix. Mol Pharmaceutics 2014, 11: 2372-2380
Puhl S, Li L, Meinel L, Germershaus O
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Correlative super-resolution fluorescence and electron microscopy of the nuclear pore complex with molecular resolution. J Cell Sci. 2014, 127: 4351-4355
Löschberger A, Franke C, Krohne G, van de Linde S, Sauer M
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Intrinsically Disordered and Pliable Starmaker-Like Protein from Medaka (Oryzias latipes) Controls the Formation of Calcium Carbonate Crystals. PLoS ONE 2014, 9(12): e114308
Rozycka M, Wojtas M, Jakob M, Stigloher C, Grzeszkowiak M, Mazur M, Ożyhar A
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Neutral sphingomyelinase in physiological and measles virus induced T cell suppression. PLoS Pathog 2014, 10(12):e1004574
Mueller N, Avota E, Collenburg L, Grassmé H, Schneider-Schaulies S
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Protein release from electrospun nonwovens: Improving the release characteristics through rational combination of polyester blend matrices with polidocanol. Int J Pharmaceutics 2014, 477: 273-281
Puhl S, Ilko D, Li L, Holzgrabe U, Meinel L, Germershaus O
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Monophyletic clades of Macaranga-pollinating thrips show high specificity to taxonomic sections of host. Biol J Linnean Soc 2015, 116:558-570
Fiala B, Wells K, Haubenreisser J, Pittroff A, Kaya-Zeeb S, Chung YC, Hashim R, Keller A
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Water loss from litchi (Litchi chinensis) and longan (Dimocarpuslongan) fruits is biphasic and controlled by a complex pericarpal transpiration barrier. Planta 2015, 242: 1207-1219
Riederer M, Arand K, Burghardt M, Huang H, Riedel M, Schuster A-C, Smirnova A, Jiang Y
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Filling the gap: adding super-resolution to array tomography for correlated ultrastructural and molecular identification of electrical synapses at the C. elegans connectome. Neurophotonics 2016, 3 (4), 041802 (May 04, 2016)
Markert SM, Britz S, Proppert S, Lang M, Witvliet D, Mulcahy B, Sauer M, Zhen M, Bessereau J-L, Stigloher C
