Fluoreszenzmikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Bereich der pharmazeutischen Technologie wird die Fluoreszenzmikroskopie in zwei unterschiedlichen Forschungsgebieten routinemäßig angewandt: (A) Arzneistofffreigabesysteme basierend auf Seidenfibroin und anderen Polymeren Trägern: Das natürlich vorkommende Biopolymer Seidenfibroin (SF) eignet sich als Matrix für die Freigabe von sensitiven Arzneistoffen. Als Arzneistoff wurde der Insulin ähnliche Wachstumsfaktor I (IGF-I) in sprühgetrocknete SF Mikropartikel und in auf Trehalose basierenden Mikropartikel für die pulmonale Applikation eingebettet. Der Transport von freigesetztem IGF-I durch das Lungenepithel konnte in einem ex-vivo humanem Lungenlappen Model erfolgreich gezeigt werden. Im Rahmen dieser Studie wurde ein Zellkulturassay etabliert, mit dem der transepithelialer Transport von IGF-I in Gegenwart von unterschiedlichen Endocytose Inhibitoren in vitro untersucht wurde. Die Ausbildung der intakten epithelialen Monoschicht der humanen Calu-3 Zelllinie wurde durch immunhistochemische Färbung der tight junctions (Marker ZO-1) und anschließender Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. Transportstudien von unterschiedlichen Wirkstoffen werden routinemäßig mit dem Calu bzw. Cacu Zellmodel im Arbeitskreis durchgeführt. In einem weiteren Projekt wurde SF über eine Azokupplung chemisch an seinen Tyrosin-Resten modifiziert, um nicht proteinogene funktionelle Gruppen (Azid-Gruppe) in das Protein einzubringen. Mit Hilfe der bio-orthogonalen Kupfer (I) katalysierte (CuAAC) Click Chemie wurden die Azid-Funktionalitäten im SF mit einem Alkin-Farbstoff modifiziert. Die Analyse der Fluoreszenz-Modifikation des SF nach CuAAC erfolgte qualitativ über die Fluoreszenzmikroskopie. Weiterhin wurde rekombinant hergestelltes FGF-2, in dem eine Alkin Funktion durch eine nicht kanonischen Aminosäure mit Hilfe des amber stop-codon Systems eingeführt wurde, an Polymerträger zielgerichtet immobilisiert. Der Nachweis der erfolgten Immobilisation erfolge über die Fluoreszenzmikroskopie. (B) Innovative Formulierungsstrategien für Proteintherapeutika: Proteinkristalle gewinnen immer mehr an Bedeutung für die Formulierung von sensiblen Arzneiformen. Als Modellprotein wurde Lysozym erfolgreich kristallisiert und durch die Methode des Electrospinning in eine bioabbaubare Polymermatrix überführt. Kristalle, welche mit Fluoresenzfarbstoff markiertem Lysozym hergestellt wurden, konnten in die Polymerfaser eingebettet werden. Durch das Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie wurde die Integrität und die Verteilung der Kristalle in der Polymermatrix beurteilt. Im Bereich der Lebensmittelchemie kam die Fluoreszenzmikroskopie in den folgenden Forschungsgebieten zum Einsatz: C) Bioaktivität von Lebensmittelinhaltsstoffen: Bei der Untersuchung der Bioaktivität von Lebensmittelinhaltsstoffen liegt der Schwerpunkt auf der Aufklärung der zugrundeliegenden Wirkmechanismen. Kürzlich wurde das in Nahrungsergänzungmitteln auf Rotkleebasis enthaltene Irilon als weiteres interessantes Isoflavon identifiziert, das aufgrund seines starken proliferationshemmenden und schwach gentoxischen Potentials sowohl eine gesundheitsfördernde als auch adverse Wirkung haben könnte. Noch unveröffentlichte Arbeiten untersuchen den mutagenen Wirkmechanismus von Patulin und strukturanalogen α,β,γ,δ-ungesättigten Laktonen. Das Methodenspektrum muss entsprechend der Ergebnisse immer wieder aktualisiert und angepasst werden, daher ist die Entwicklung und Validierung neuer, möglichst standardisierbarer, fluoreszenzmikroskopischer Auswertemethoden ein unverzichtbarer Bestandteil der Arbeiten. (D) Genotoxizität von Antiinfektiva: Wenn ein unerwünschtes genotoxisches Potential von Wirkstoffen frühzeitig im Entwicklungsprozess erkannt und die Struktur-Wirkung-Beziehungen aufgeklärt werden kann, können vielversprechende Wirkstoffe durch gezielte Synthese systematisch weiterentwickelt werden. Es wurden Wirkstoffe aus den Klassen der Isochinoline, Fluoroquinolone, Naphthalimide und Hybridderivate untersucht. Zur Optimierung der eingesetzte Genotoxizitätstests wurden die Möglichkeiten und Grenzen automatisierter Auswertemethoden und der Lebendzellmikroskopie beschrieben. (E) Ein neuartiger Genotoyp-selektiver Mutationstest in Rattenzellen: Entwicklung, Validierung und Vergleich mit klassischen in vitro Genotoxizitätstests. Der Vergleich neu entwickelter Testsysteme mit etablierten Genotoxizitätstests bekannter Vor- und Nachteile, wie dem Mikrokerntest, stellt einen wichtigen Teil bei der Bewertung der Eignung neuer Testsysteme dar.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Controlled protein delivery from electrospun nonwovens: Novel combination of protein crystals and a biodegradable matrix. (2014) Mol Pharm 11, 7 2372 −80
Puhl, S., Li, L., Meinel, L. and Germershaus, O.
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Decoration of silk fibroin by click chemistry for biomedical application. (2014) J Struct Biol., 186, 420–430
Zhao, H., Heusler, E., Jones, G., Li, L., Werner, V., Germershaus, O., Ritzer, J., Luehmann, T., and Meinel, L.
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Bio-orthogonal immobilization of fibroblast growth factor 2 for spatial controlled cell proliferation. (2015) ACS Biomater. Sci. Eng, 1 (9), 740−746. Cover article
Lühmann, T., Jones, G., Gutmann M., Rybak J.C., Nickel, J., Rubini M., and Meinel, L.
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Data in support of the mutagenic potential of the isoflavone irilone in cultured V79 cells. Data Brief. 2015 Jul 17;4:474-87.
Scheffler, A., Albrecht, A.E., Esch, H.L., Lehmann, L.
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Mutagenic potential of the isoflavone irilone in cultured V79 cells. Toxicol Lett. 2015 Apr 16; 234(2):81-91
Scheffler, A., Albrecht, A.E., Esch, H.L., Lehmann, L.
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Pulmonary insulin-like growth factor I delivery from trehalose and silk-fibroin microparticles. (2015) ACS Biomater. Sci. Eng., 1 (2), 119–129
Schultz, I., Vollmers, F., Luehmann, T., Rybak, J.C., Wittmann, R., Stank, K., Steckel, H., Kardziev, B., Schmidt, M., Högger P., and Meinel, L.
