Etablierung eines zuverlässigen, effizienten und umfassenden Ansatzes für die Mutationsanalyse bei Myelodysplastischen Syndromen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In dem beantragten Projekt ging es um die Etablierung der Solid-Sequenzierung für die Mutationsanalyse in myeloischen Neoplasien. Die zuvor entwickelte Amplicon-Sequenzierung für das Sanger-Sequenzieren sollte auf die Next Generation Sequencing-Technologie übertragen werden. Dazu entwickelten wir ein Protokoll, das einen Ligationsschritt der amplifizierten PCR-Produkte und eine Fragmentierung beinhaltet. Mit diesem Protokoll konnten wir die Sequenzierung von 33 Genen, für die Mutationen in myeloischen Neoplasien beschrieben wurden, erfolgreich für die Solid-Sequenzierung etablieren. Für die Datenanalyse wurde die kommerzielle Software-DNA-Nexus und eine Pipeline von bioinformatischen Analysen etabliert. Als Voraussetzung für die Validierung einer Mutation entschieden wir uns dafür, Mutationen anzuerkennen, wenn sie mit der Sanger-Sequenzierung validierbar waren. Somit haben wir die Solid-Sequenzierung als Screening Tool verwendet und haben den gleichen Qualitätsstand wie in den bisherigen Untersuchungen, die ausschließlich auf der Sanger-Sequenzierung beruhen. Auf Grundlage der erfolgreichen Proof of principle-Studie gehen die Untersuchungen in MDS-Patienten weiter. Da das Solid-Sequenziergerät eine hohe Kapazität hat, sehen wir die bevorzugte Anwendung dieser Sequenziermethode in der retrospektiven Analyse von großen Patientenkohorten und weniger in der raschen molekularen Charakterisierung in der klinischen Diagnostik.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Next generation sequencing for minimal residual disease monitoring in AML patients with FLT3-ITD or NPM1 mutations. Genes Chromosomes Cancer. 2012 Jul;51(7):689-95
Felicitas Thol, Britta Kölking, Frederik Damm, Katarina Reinhardt, Jan-Henning Klusmann, Dirk Reinhardt, Nils von Neuhoff, Martijn H. Brugman, Brigitte Schlegelberger, Sebastian Suerbaum, Jürgen Krauter, Arnold Ganser, and Michael Heuser
