Mechanismus der AF4 Komplex-abhängigen Transkriptionsaktivierung durch virale Proteine
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In diesem Projekt ging es um verschiedene funktionelle Aspekte des AF4-Komplexes und des onkogenen AF4-MLL Fusionsproteins. Das AF4-MLL Fusionsprotein entsteht durch die chromosomale Translokation t(4;11)(q21;q23). Diese Chromosomen-Translokation führt zur Bildung der beiden reziproken Fusionsgene MLL-AF4 und AF4-MLL. Die Expression der beiden Fusionsproteine geht mit der Entwicklung einer Akuten Lymphoblastischen Leukämie (ALL) einher. Diese spezielle Erkrankung wird dominant bei Säuglingen diagnostiziert (70% aller Säuglingsleukämien) und bei ca. 10% aller Kinder- und Erwachsenenleukämien. Im Mausmodell zeigte die alleinige Expression von AF4-MLL eine Leukämieentwicklung bei ca. 35% aller Mäuse. Alle Leukämiemäuse zeigten einen ALL Phänotyp und transkribierten das AF4-MLL Transgen bei Diagnose, während die nichterkrankten Mäuse (65%) keine Expression zeigten (aufgrund einer MOI von nur 0,01 durch überlange Vektoren von 12-14 kb für die retrovirale Verpackung). Wir haben in diesem Projekt folgende Dinge erfolgreich bearbeitet. Wir haben zunächst ein neues Tool entwickelt, mit dessen Hilfe Zellkulturexperimente dramatisch vereinfacht werden können: ein neues Sleeping Beauty Transposonsystem. Diese neue Tool erlaubt es, stabile Zelllinien binnen einer Woche zu etablieren (Zellen züchten, transfizieren und selektionieren). Damit können sehr reproduzierbare Experimente mit Transgenen in Säugerzellen durchgeführt werden. Diese System wurde zunächst mit verschiedenen MLL Fusionsgenen getestet, und dann mit dem AF4 Gen und dem AF4N Gen durchgeführt. Die beiden letzgenannten Gene waren Strep-getaggt, sodass wir die Komplexe biochemisch reinigen und molekular charakterisieren konnten. Mithilfe dieser Systeme konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass der AF4N Komplex neben p-TEFb auch noch TFIIH enthält, sodass der kleinere AF4N Komplex sowohl Transkriptionsinitiation als auch die -elongation steuern kann. Zudem binden virale immediate early Proteine an beide Komplexe und machen - zumindest für 2 der hier untersuchten viralen Proteine gezeigt - spezifische Interaktionen mit Komplexpartnern beider Proteinkomplexe (noch unpubliziert). In einem weiteren Projekt wurde die Rolle von DDX6 in der Rekrutierung von P-TEFb untersucht. P-TEFb ist im onkogenen AF4-MLL komplex hyperaktiv und führt so zu einer dramatischen Steigerung der Gesamt mRNA Produktion in solchen Zellen. Wir konnten hier zeigen, wie das RNA bindende DDX6 Protein unter normalen physiologischen Bedingungen die P-TEFb Kinase aus dem 7SK RNP rekrutiert und zum AF4 oder AF4N Komplex bringt. Die Menge an DDX6 und AF4 ist dabei auschlaggebend, wieviel mRNA in Zellen hergestellt werden kann. Wir konnten durch knockdown und Überexpressions-Experimente zeigen, dass die mRNA Menge in Säugerzellen auf diese Weise auf Werte zwischen 30% und 1100% bezüglich der Referenzzelle moduliert werden kann. Wir haben auch die Endopeptidase Taspase1 studiert und seine Funktionen weiter aufgeklärt. Ohne Taspase1 wird das AF4-MLL Onkoprotein durch proteolytischen Abbau in der Zelle eliminiert. Wir konnten den Aktivierungsmechanismus für Taspase1 aufklären und eine dominant-negative Mutante von Taspase1 herstellen. Diese Arbeiten bergen ein grosses therapeutisches Potential. Zum Schluss haben wir die Elongationskontrolle im ALOX5 Gen studiert. Diese Kontrolle liegt beim ALOX5 Gen ca. 70 kb unterhalb des Promotors und erlaubte so funktionelle Studien mit den beiden Proteinkomplexen AF4 und AF4-MLL durchzuführen. In diesen Studien konnte klar gezeigt werden, dass beide Proteine in Zellen die Elongationskontrolle durchführen, AF4-MLL aber dramatisch viel stärker - aber abhängig von HDAC3 (Klasse I HDAC). Zudem ist im ALOX5 Gen die Elongationskontrolle vollständig abhängig vom VITD3/RXR Rezeptor, der den AF4 oder AF4-MLL Komplex an das Chromatin rekrutiert. Weitere Arbeiten innerhalb dieses Projektes betreffen das IRX1 Protein, von dem wir zeigen konnten, dass es dominant-negativ das MLL-AF4 Fusionsprotein in seiner Funktion beeinträchtigt. Die Gabe von Klasse I HDACi blockierte das MLL-AF4 Fusionprotein auch in Gegenwart von IRX1, reaktivierte aber wiederum das endogene MLL Protein. Dies wurde am Chromatin von HOXA9 und HOXA10 gezeigt. Damit tun sich für uns völlig neue therapeutische Möglichkeiten auf, um die beiden Fusionsproteins MLL-AF4 und AF4-MLL entweder molekular (IRX1 oder dnTASP1) oder pharmakologisch (Klasse I HDACi) zu adressieren. Zukünftige Arbeiten sollen diese neue Konzept validieren. Ein eingeladener Review über die neue Funktionen der insgesamt über 80 bekannten MLL Fusionspartner und neue Ansichten zu pathologischen Krebsmechanismen bei MLL-Leukämien rundete dieses Projekt ab.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2014). Functional characterization of different MLL fusion proteins by using inducible Sleeping Beauty vectors. Cancer Letters 352, 196-202
Wächter K, Kowarz E, Marschalek R
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(2015), AF4 and AF4N protein: recruitment of P-TEFb kinase, their interactome and potential functions. Am J Blood Res 5, 10-24
Scholz B, Kowarz E, Rössler T, Ahmad K, Steinhilber D, Marschalek R
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(2015). AF4 and AF4- MLL mediate transcriptional elongation of 5-lipoxygenase mRNA by 1,25-dihydroxyvitamin D3. Oncotarget 6, 25784-800
Ahmad K, Scholz B, Capelo R, Kahn AS, Marschalek R, Steinhilber D
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(2015). Optimzed Sleeping Beauty rapidly generate stable transgenic cell lines. Biotechnology J 10, 647-653
Kowarz E, Löscher D, Marschalek R
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(2015). Unraveling the activation mechanism of Taspase1 which controls the oncogenic AF4-MLL fusion protein. EBioMedicine 2, 386-395
Sabiani S, Geppert T, Engelbrecht C, Kowarz E, Schneider G, Marschalek R
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(2016). Systematic Classification of Mixed-Lineage Leukemia Fusion Partners Predicts Additional Cancer Pathways. Ann Lab Med 36, 85-100
Marschalek R
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(2016). The IRX1/HOXA connection: insights into a novel t(4;11)-specific cancer mechanism. Oncotarget. 2016 May 9
Kühn A, Löscher D, Marschalek R
