The molybdo-proteome of N. crassa mitochondria
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Sulfit-Oxidase (SO) ist essentiell für die Detoxifizierung von Sulfit. Sie wird im Zytoplasma translatiert, ist aber enzymatisch im IMS der Mitochondrien aktiv. Welche Komponenten dort seine Assemblierung mit prostethischen Gruppen realisiert, ist unbekannt. Voraussetzung für die Aufklärung dieses Netzwerks ist eine eindeutige Bestandsaufnahme der mitochondrialen Proteine im Modellsystem N. crassa. In diesem Projekt wurde nun ein Verfahren zur Isolation sehr reiner Mitochondrien entwickelt. Qualitätskontrollen (EM, Western Blots, Oxidase-Aktivitätsassays und Massenspektrometrie) bestätigten strukturell intakte und physiologisch aktive Mitochondrien. Die neue Strategie ermöglichte die zweifelsfreie Erkennung mitochondrialer Komponenten auf Basis charakteristischer quantitativer Profile bei deren Anreicherung. Insgesamt wurde 512 mitochondriale Proteine identifiziert; wobei 57 erstmals in N. crassa beschrieben wurden. Die Lokalisation ausgewählter neuer Proteinfunktionen wurde durch mikroskopische Analysen bestätigt und zielgerichtete Proteomanalysen konnten letztlich IMS lokalisierte SO sowie Matrix lokalisiertes NIt7 nachweisen. Zudem haben wir belegt, dass Cystein-reiches Medium signifikant die Menge mitochondrialer und aktiver SO induziert, wodurch auch die Validierung und Etablierung eines neuen hochspezifischen SO-Antikörpers ermöglicht wurde. Allerdings bleibt die Analyse der IMS-lokalisierten SO Assemblierung auch zukünftig eine Herausforderung. Eine eindeutige Definition des mitochondrialen Proteoms von N. crassa (inkl. IMS Proteinen), die Validierung SO-induzierender Kulturbedingungen und die Etablierung eines monoklonalen SO-Antikörpers für INteraktomstudien haben jedoch den Weg für seine Aufklärung bereitet, welchen wir gemeinsam mit TP1 fortsetzen werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
-
Genetic characterization of the Neurospora crassa molybdenum cofactor biosynthesis. Fungal Genet Biol. (2014) 66:69-78
Probst C, Ringel P, Boysen V, Wirsing L, Alexander MM, Mendel RR, Kruse T
-
Linear Discriminant Analysis Identifies Mitochondrially Localized Proteins in Neurospora crassa. J Proteome Res. (2015) 4;14(9):3900-11
Wirsing L, Klawonn F, Sassen WA, Lünsdorf H, Probst C, Hust M, Mendel RR, Kruse T, Jänsch L
