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Projekt
Trityl-Radikale: Neue Spinlabel für Nanometerabstandsmessungen mit höherer Sensitivität, bei Raumtemperatur und in Zellen
Antragsteller
Dr. Gregor Hagelueken; Professor Dr. Olav Schiemann
Fachliche Zuordnung
Analytische Chemie
Förderung
Förderung von 2012 bis 2020
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 221209300
Strukturbiologische Fragestellungen beziehen sich auf immer größere Proteine in immer komplexeren Umgebungen wie Membranen oder ganzen Zellen. Die EPR-Spektroskopie bietet hierfür Methoden an, die es durch Messung der dipolaren Kopplung zwischen Spinzentren ermöglichen, Strukturen und Strukturänderungen im Nanometerbereich zu bestimmen. Beispiele für solche Methoden sind cw EPR, Pulsed Electron-Electron Double Resonance (PELDOR) und Double Quantum Coherence (DQC) Experimente. Da viele der zu untersuchenden Proteine diamagnetisch sind, müssen sie für solche Experimente mit Spinlabeln, meistens Nitroxidverbindungen, markiert werden. Deren chemische sowie EPR-spektroskopischen Eigenschaften führen jedoch zu mehreren Limitationen, z.B. müssen die Messungen mit gefrorenen Proben durchgeführt werden. In der vorherigen Antragsperiode konnten wir zeigen, dass viele dieser Limitationen durch Verwendung von Trityl-Spinlabeln aufgehoben oder zumindest signifikant verbessert werden. Wir haben zwei Trityllabel für Nanomaterialien und ein Trityllabel für das selektives Markieren von Cysteinen in Proteinen synthetisiert. Wir haben gezeigt, dass bei Verwendung von Tritylradikalen anstelle von Nitroxiden, die Sensitivität von Abstandsmessungen in Abhängigkeit der verwendeten EPR-Methode um den Faktor 2 bis 30 größer wird. Wir konnten an Bistrityl-Verbindungen zeigen, dass die Breiten der erhaltenen Abstandsverteilungen vergleichbar mit denen von Nitroxiden sind. Und es zeigte sich, dass die Trityllabel deutlich stabiler unter In-Zell-Bedingungen sind als Nitroxide. In der neuen Antragsperiode wollen wir nun Trityllabel und EPR-basierte Abstandsmethoden dazu verwenden, um die konformationellen Strukturänderungen in den beiden membranständigen, molekularen Maschinen FeoB und YopO unter Tieftemperatur- und Raumtemperaturbedingugen, sowie in vitro und in Zellen zu untersuchen. Für die In-Zell Experimente werden wir Trityllabel synthetisieren, welche mittels Thioether anstatt Disulfidbrücken an das YopO Protein gekoppelt sind. Für FeoB werden wir neue Trityllabel synthetisieren mit denen unnatürliche Aminosäuren markiert werden können. Wir werden mit verschiedenen Membransystemen und nativen Cytoskelett-Proteinen (F-Actin) diese Proteine in ihrer natürlichen Umgebung immobilisieren und darauf hinarbeiten unter diesen Bedingungen Abstandsmessungen bei Raumtemperatur zu ermöglichen.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
