Development of a biohybrid lung - Preventing rejection of allogenic endothelial cells by HLA-class I silencing
Final Report Abstract
Bei steigender Inzidenz und Prävalenz belegen Lungenerkrankungen derzeit den sechsten Platz der WHO-Todesursachenstatistik. Für Patienten mit präterminalen Lungenerkrankungen existiert aktuell kein dauerhaft einsetzbares Organersatzverfahren, sodass die Lungentransplantation (LTX) die einzig kurative Therapieoption darstellt, die jedoch nur einem äußerst selektionierten Patientengut vorbehalten ist. Im Falle eines pulmonalen Organversagens gibt es neben der maschinellen Beatmung die sogenannte extrakorporale Membranoxygenierung (ECMO), die temporär den Gasaustausch des Patienten gewährleisten kann. Der klinische Einsatz dieses Systems ist jedoch aufgrund des unvermeidbaren Kontaktes zwischen den artifiziellen Oberflächen und dem zirkulierenden Blut und den daraus entstehenden unerwünschten systemischen Reaktionen (z. B. Thrombenbildung) bis auf wenige Wochen limitiert. Dies veranschaulicht die Dringlichkeit der Entwicklung eines dauerhaft einsetzbaren pulmonalen Unterstützungssystem. Daher ist das langfristige Ziel dieses Forschungsprojektes die Entwicklung einer implantierbaren Biohybridlunge (BH), die die Gasaustauschfunktion der erkrankten Lungen unterstützen bzw. sogar vollständig ersetzen kann, ohne die genannten systemischen Reaktionen zu initiieren und somit als alternative Therapieoption zur LTX eingesetzt werden kann. Im Rahmen dieses Projektes wurden hierfür erste vielversprechende Schritte realisiert. Die Funktionsweise der BH basiert auf dem Prinzip der ECMO, d.h. der Gasaustausch erfolgt über die potentiell thrombogenen Poly-4-Methyl-1-Pentene (PMP) Gasaustauschmembranen. Um die langfristige Anwendung der BH sicherzustellen, wurden diese blutkontaktierenden PMP-Oberflächen mit humanen Endothelzellen (EC) besiedelt, sodass dadurch eine homogene, hämokompatible Oberfläche geschaffen wurde. Dieser endotheliale Monolayer auf den PMP muss jedoch für den erfolgreichen Langzeiteinsatz der BH Blutflüssen von >5l/min Stand halten. Für die Bearbeitung dieses klinisch relevanten Aspektes wurden in diesem Projekt verschiedene Analysen an 2D-PMP- Folien, aber auch 3D-PMP-Membranen durchgeführt. Um die Adhärenz der ECs auf den initial hydrophoben PMP zu optimieren, wurden einerseits weitere PMP-Beschichtungen (u. a. Titandioxid, Aminocellulose, Fibronektin) etabliert und hinsichtlich ihrer Gasaustauschkapazität, Biokompatibilität (u. a. Thrombozyten- und Leukozytenadhärenz), sowie der Interaktion zwischen PMP und ECs analysiert (u. a. Besiedlungseffizienz, physiologische Aktivierbarkeit der ECs, Flusskonstanz). Hierbei erwiesen sich neben dem bewährten Heparin-/Albumin auch Titandioxid und Fibronektin als geeignete alternative PMP- Beschichtungen. Andererseits konnte in weiteren Experimenten gezeigt werden, dass neben der optimalen PMP-Beschichtung auch das initiale Endothelialisierungsprotokoll für die endotheliale Flusskonstanz von elementarer Bedeutung ist. Insbesondere vor dem Hintergrund, dass die zu endothelialsierende Oberfläche einer funktionsfähigen BH >1.5m2 ist, hat sich dieses Projekt des weiteren auf die Identifizierung einer geeigneten Zellquelle fokussiert. Hierfür wären zweifelsohne autologe ECs wünschenswert, doch deren Generierung ist nicht effektiv genug. Das grundsätzliche Problem allogener ECs liegt in ihren Majorhistokompatilibiltätsantigenen (MHC), anhand derer das Immunsystem körperfremde Zellen erkennt und abstößt. Im Rahmen dieses Projektes konnte die effektive Inaktivierung der MHC-Klasse I Gene etabliert werden. In funktionellen, immunologischen Assays (u. a. allogene zytotoxische T-Zell- und NK-Zelleffekte, antikörpervermittelte komplement-assoziierte Zytotoxizität, Analyse von Immunzelladhärenz und -migration) konnte gezeigt werden, dass diese MHC-Klasse I gesilencten ECs für das Immunsystem unsichtbar sind. Somit führt die Verwendung dieser ECs für die PMP- Endothelialisierung nicht nur zu einer signifikant verbesserten Hämokompatibilität, sondern macht deren Oberfläche zudem noch immunologisch kompatibel. Um die in-vitro erhobenen Daten nachfolgend in-vivo im Rattenmodell zu untersuchen, wurden in diesem Projekt u. a. Primer, Antikörper und das MHC-Silencing für Rattenendothelzellen, analog den humanen ECs, etabliert. Zudem wurden für die spätere Analyse der BH- Anwendung im Rattenmodell maßgebliche chirurgische Aspekte und Techniken erfolgreich etabliert (u. a. ECMO-Rattenmodell mit Narkoseführung, Kanülierung und Integration des BH- Bioreaktors in den Rattenkreislauf).
Publications
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