Konfokales Laserscanmikroskop
Final Report Abstract
Mit Hilfe des konfokalen Laser Scanning Mikroskops (KLSM) wurden unmittelbar nach der Anschaffung verschiedene Projekte bearbeitet. Eine Auflistung der thematischen Schwerpunkte wird hier dargestellt. Das CLSM wurde in verschiedenen DFG-Projekten, EU-Projekten (COST CM1001) und weiteren (z.B. Alexander-von-Humboldt-Stiftung) verwendet. Weiterhin wurde das Gerät in Spezialkursen der Ausbildung für Masterstudenten der Ernährungswissenschaft verwendet und in Master- und Doktorarbeiten zur Erfüllung der entsprechenden Forschungsaufgaben eingesetzt. Einfluss von Mitochondrien auf die Bildung von Lipofuscin. Wir haben den Nachweis erbracht, dass eine seneszenzbedingte Beeinträchtigung mitochondrialer Abbauwege die Lipofuscinakkumulation fördert und dass die Mitophagie seneszenter Zellen im Vergleich zu jüngeren verringert ist. Untersuchung der Kolokalisation von Mitochondrien, lysosomalem System und Lipofuscin erfolgte mit hoher Ortsauflösung/Konfokalität unter Verwendung der geräteeigenen Software. Einfluss verringerter Autophagie auf den Turnover von Ferritin H. Mittels Kolokalisation lysosomaler Proteine (Lamp2A, LC3) und des Ferritin H konnte gezeigt werden, dass Autophagie maßgeblich für den Turnover von Ferritin H verantwortlich und beides in seneszenten humanen Fibroblasten im Vergleich zu jungen Zellen verringert ist. Die notwendige hochauflösende Kolokalisation verschiedener Proteine war nur mittels Konfokalmikroskopie und der geräteeigenen Software zur en entsprechenden Quantifizierung möglich. Effekte wassergefilterter Infrarot-A-Strahlung (wIRA) auf lebende humane Fibroblasten unter konstanter physiologischer Temperatur. Wir konnten den Nachweis erbringen, dass viele beschriebene Effekte von wIRA (ROS-Bildung, Änderung des mitochondrialen Membranpotenzials und der intrazellulären Ca2+-Konzentration) rein thermaler Natur sind. Weiterhin zeigten wir eine (athermale) DNA-protektive Wirkung von wIRA gegen subsequente UVB- Exposition. Der nötige Vergleich zweier zeitgleich aufgenommener Emissionsmaxima bei hoher Ortsauflösung an lebenden Zellen wäre ohne Konfokalmikroskopie, temperierbare Atmosphärenkammer und entsprechende Software nicht möglich gewesen. Untersuchung redox-regulierter zellulärer Signalkaskaden. Mittels Konfokalmikroskopie konnten wir die Translokation von Nrf2 in den Zellkern darstellen und erstmals die essentielle Rolle von HDAC6 (Deacetylierung der Kinase p38 während Inhibition des proteasomal Systems) bei der Induktion von Nrf-2 und HO-1 aufklären. In Abhängigkeit von oxidativem Stress wurden die redox-regulierten Transkriptionsfaktoren Nrf2, HIF und NF-B in mit Krebsstammzellen angereicherten Spheroiden untersucht, welche eine bemerkenswerte Koordination besagter Faktoren während der Spheroidentwicklung zeigten, die in konventionellen Zellmodellen nicht vorkommen. Im Gegensatz zu herkömmlicher Fluoreszenzmikroskopie war es nur mittels Konfokalmikroskopie möglich, Einblick in 3-dimensionale Zellaggregate durch mehrere Zellschichten hindurch zu erhalten und entsprechende intrazelluläre Proteinverteilungen zu untersuchen. Interaktion zwischen Hsp70, oxidierten Proteinen und dem 20S Proteasom. Durch Verwendung der konfokalmikroskopischen Methode FRAP konnte in Einzelzellen eine Interaktion zwischen Hsp70 und dem 20S Proteasom, ebenso wie eine Interaktion zwischen Hsp70 und oxidierten Proteinen nachgewiesen werden, was wiederum auf eine Rolle des Hsp70 beim Abbau oxidierter Proteine durch 20S hindeutet. Hsp70 ist somit ein mögliches Ziel therapeutischer Ansätze zur Stabilisierung der zellulären Protein-Homöostase. Neuartige, hochspezifische und schnelle Färbemethode für Carbonyle. Die neuartige Färbemethode (mittels Coumarin-Hydrazid) für Carbonyle (am häufigsten verwendeter Marker oxidativer Modifikation organischer Moleküle) wurde mit der bereits etablierten (2,4- Dinitrophenylhydrazin) verglichen. Mittels Konfokalmikroskopie war es möglich, hochauflösend die gleichen perinukleären Verteilungen (und somit die Vergleichbarkeit) beider Carbonyl-Nachweismethoden zu zeigen (3D-Rekonstruktion der räumlichen Verteilung aus konfokalmikroskopischen Schnittbildern). Oxidative Modifikation des 20S Proteasoms. Nachweis einer instabilen oxidativen Modifikation (Adduktbildung mit 4-Hydroxynonenal) der alpha7- Untereinheit des 20S Proteasoms mittels Immunchemie. Besagte Modifikation stellt womöglich einen bisher unbekannten Regulationsmechanismus proteasomaler Aktivität dar. Durch Konfokalmikroskopie konnte die intrazelluläre Verteilung der Modifikation mit hoher Ortsauflösung untersucht werden (3D-Rekonstruktion aus Schnittbildern). Verbesserung des BALB/c-3T3 Zelltransformations-Modells. Das in der Überschrift erwähnte Modell wurde mittels KLSM untersucht und weiteren Applikationen der Proteinanalyse (Immunoblot, subzelluläre Fraktionierung und Immunfluoreszenz), sowie Parametern des zellulären Energieumsatzes (Glucose- und Sauerstoffverbrauch) kombiniert, um die Mechanismen maligner Zelltransformation besser zu verstehen. BALB/c-3T3 erwies sich als hervorragendes Modell zur Untersuchung von Veränderungen bei Schlüsselproteinen oder Energieparametern während verschiedener Stadien der Transformation. Einfluss des Insulin-IGF-Signaling auf Zelltransformation im BALB/c 3T3-Modell. Die Anwendung des IR/IGF-1R-Inhibitors OSI-906 resultierte bei chronischer Exposition in einer Verringerung der Transformation, kurzzeitige Exposition zeigte präventive Effekte in der Promotionsphase. BALB/c 3T3 erwies sich somit als nützliches Modell zur Identifikation effektiver Krebstherapien. Die in diesem Projekt benötigte Möglichkeit der Lebendzellbeobachtung unter hoher Ortsauflösung war nur mittels KLSM gegeben.
Publications
- (2017) Mitochondrial contribution to lipofuscin formation. Redox biology 11 673–681
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