Time resolved fluorescence detection utilising two photon excitation in microfluidic separation systems
Final Report Abstract
Im vorliegenden Projekt wurde eine neue Methode zur markierungsfreien Detektion im tiefen UV in mikrofluidischen Trennsystemen auf Grundlage der zweiphotoneninduzierten Fluoreszenzdetektion erarbeitet. Nach erfolgreicher Entwicklung eines instrumentellen Aufbaus wurde die Technik für verschiedene Trennverfahren und unterschiedliche Mikrochipmaterialien untersucht. Durch Verwendung von sichtbarem Anregungslicht wurde die Methode in Borosilikatglas-Chips sowohl in der miniaturisierten Elektrophorese als auch in der Elektrochromatographie erfolgreich eingesetzt. Darüber hinaus ermöglichte der Einsatz der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung die Fluoreszenzlebenszeiten der Analytmoleküle während der Trennung zu bestimmen. Diese Daten lieferten hierdurch eine zusätzliche Dimension bei der Zuordnung und Identifikation von Substanzen, wie am Beispiel der Analyse von Harman-Alkaloiden einer Pflanzenprobe gezeigt werden konnte. In einem weiteren Schritt wurden flüssigphasenlithographisch gefertigte Mikrochips mit Objektträgern als Bodenplatte untersucht. Durch geeignete Wahl der Substratdimensionen konnte hierbei das Potenzial der zweiphotoneninduzierten Fluoreszenzdetektion noch besser ausgenutzt werden, indem Immersionsobjektive mit hoher numerischer Apertur zugänglich wurden. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde die Technik erfolgreich in der Mikrochipelektrophorese in Polymersubstraten eingesetzt. Durch Optimierung des Fokussierungsprozesses konnten hohe Anregungslaserleistungen in diesen wärmeempfindlichen Materialien realisiert und dadurch niedrige Nachweisgrenzen im unterem mikromolaren Bereich erzielt werden. Dies wurde anhand der quantitativen Bestimmung von Tryptamin in Früchten dokumentiert. Die im Rahmen dieses Projektes entwickelte Methode der zweiphotoneninduzierten Fluoreszenzdetektion erweitert somit die Möglichkeiten miniaturisierter Verfahren und erlaubt den Einsatz einfach herzustellender polymerbasierter Mikrochips bei der Anregung im tiefen UV-Bereich. Sie ist eine attraktive Alternative im Bereich der sensitiven, markierungsfreien Detektion.
Publications
- “Label-free fluorescence detection of aromatic compounds in chip electrophoresis applying two photon excitation and time-correlated single photon counting”, Anal. Chem. 2013, 85, 8150-8157
R. Beyreiss, D. Geißler, S. Ohla, S. Nagl, T. N. Posch, D. Belder
(See online at https://doi.org/10.1021/ac4010937) - “Protein–protein interaction analysis in single microfluidic droplets using FRET and fluorescence lifetime detection”, Lab Chip 2013, 13, 2808-2814
C. Benz, H. Retzbach, S. Nagl, D. Belder
(See online at https://doi.org/10.1039/c3lc00057e) - “Rapid Prototyping of Electrochromatography Chips for Improved Two-Photon Excited Fluorescence Detection”, Anal. Chem. 2014, 86, 3773–3779
C. Hackl, R. Beyreiss, D. Geissler, S. Jezierski, D. Belder
(See online at https://doi.org/10.1021/ac500793e) - "Two-photon excitation in chip electrophoresis enabling label-free fluorescence detection in non-UV transparent full-body polymer chips ", Electrophoresis 2015, 36, 2976-2983
D. Geissler, D. Belder
(See online at https://doi.org/10.1002/elps.201500192)
