Konfokales Zweifarben-Fluoreszenzmikroskop
Final Report Abstract
Die Forschungsaktivitäten in der AG Biophysik haben zum Ziel ein fundamentales physikbasiertes Verständnis zur Funktionsweise biologischer makromolekularer Systeme zu erlangen. In diesem Zusammenhang sind für uns Proteine (proteinbasierte) makromolekulare Komplexe, auch im Wechselspiel innerhalb ihres zellulären Kontextes, von besonderem Interesse. Wir wenden dabei fluoreszenzbasierte Techniken an, welche die Möglichkeiten bieten Proteineigenschaften und Interaktionen mit hoher Empfindlichkeit und Selektivität zu untersuchen. Mit dem angeschafften Gerät fokussieren wir uns auf Multi-Parameter Fluoreszenzanalysen. Die Haupttechniken, die hierbei mit dem angeschafften Gerät zur Anwendung kommen, sind Einzelmolekül Förster-Resonanzenergietransfer (smFRET), Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie (TRA) und Zweifarben-Koinzidenz Detektion (TCCD). So haben wir die interne Dynamik eines Zweidomänen Proteins im Wechselspiel mit der Substratbindung dieses Enzyms mit Hilfe von smFRET Studien charakterisiert. In einem anderen Beispiel konnten wir naszierende Polypeptideketten welche in situ von Ribosomen synthetisiert wurden, bezüglich Ihrer Struktur und ihrer Interaktion mit dem Ribosom untersuchen. Zusätzlich zu solchen Anwendungsbeispielen liegt ein starker Fokus unserer Arbeiten mit dem Gerät darauf, methodische Weiterentwicklungen für verbesserte und bisher unzugängliche Anwendungen durchzuführen. Hierbei wurden zum einen die Kombinationen von Lebensdauermessungen und Fluoreszenzintensitäten zur Berechnung der FRET Transfereffizienz und damit zur Analyse von schnelle Interdomänenbewegungen genutzt. In einem weiteren Beispiel haben wir mit dem Konfokalmikroskop eine neue Methode entwickelt, die es ermöglicht akkurate Fluoreszenzquantenausbeuten von Farbstoffen in Proben mit sehr geringer Konzentration zu bestimmen. Im letzten Jahr haben wir darüber hinaus begonnen Proteineigenschaften in hochviskosen Medien („crowded solutions“) mit dem Konfokalmikroskop zu untersuchen. Neben wichtigen Kalibrierungsmessungen für eine quantitative Analyse der Messdaten in solchen Medien, die mit einem erhöhten Brechungsindex einhergehen, kamen hier hauptsächlich FCS, smFRET und TRA zur Charakterisierung der Translations-, der Rotationsbeweglichkeit und der internen Proteindynamik zur Anwendung. Zahlreiche Aspekte dieser Arbeiten sind in Bachelor- und Masterarbeiten dargestellt und werden derzeit für weitere Publikationen vervollständigt.
Publications
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Conformational State Distribution and Catalytically Relevant Dynamics of a Hinge-Bending Enzyme Studied by Single-Molecule FRET and a Coarse-Grained Simulation. Biophys. J., 107, 1913-1923, (2014)
M. Gabba et al.
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Inter-dye Distance Distributions Studied by a Combination of Single-Molecule FRET-Filtered Lifetime Measurements and a Weighted Accessible Volume (wAV) Algorithm. Molecules, 11, 19269-19291, (2014)
H. Höfig et al.
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Nanosecond Dynamics of Calmodulin and Ribosome-Bound Nascent Chains Studied by Time-Resolved Fluorescence Anisotropy. ChemBioChem, 15, 977-985, (2014)
P. Lamprou et al.
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Accurate Fluorescence Quantum Yield Determination by Fluorescence Correlation Spectroscopy J. Phys. Chem. B, 119, 4668-4672, (2015)
D. Kempe et al.
