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Projekt
Programmierbare und chemoselektive Protein-DNA Verknüpfung für die sensitive Detektion von 5-Formylcytosin
Antragsteller
Professor Dr. Daniel Summerer
Fachliche Zuordnung
Biologische und Biomimetische Chemie
Förderung
Förderung von 2012 bis 2020
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 223355544
5-Formylcytosine (fC) ist die siebte Nukleobase des Säugergenoms. Vor kurzem wurde entdeckt, dass fC hohe Gehalte in Genen aufweist, die mit der Transkription und Differenzierung assoziiert sind, und Kristallstrukturen haben gezeigt, daß seine Anwesenheit in DNA die Duplexstruktur signifikant stören kann. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle von fC in der Regulation der Genexpression hin. Der zugrunde liegende Kontrollmechanismus potentieller Funktionen ist jedoch die Einführung und Entfernung von fC in DNA, d.h. seine Dynamik. Einsichten in diesen Aspekt sind entscheidend für ein vollständiges Verständnis der Funktionen von fC, konnten aber in früheren Studien nicht gewonnen werden, da diese sich auf statische Aspekte beschränkten. Dynamische Messungen von fC erfordern einfache und sensitive Assays für die zeitaufgelöste Quantifizierung von fC an relevanten genomischen Loci. Allerdings besitzen derzeitige Nachweismethoden für fC keine direkte Sequenzselektivität, was zu Nachteilen bzgl. ihrer Einfachheit und / oder Auflösung führt.Wir haben vor kurzem wurde das Konzept der erweiterten Programmierbarkeit der DNA-Erkennung eingeführt. Dieses basiert auf TALE Proteinen, die aus multiplen, verketteten Wiederholungseinheiten mit jeweiligen Selektivitäten für die Erkennung sowohl kanonischer als auch epigenetischer Nukleobasen in DNA bestehen. Mit diesem Projekt - um den besonderen Anforderungen der fC Erkennung Rechnung zu tragen - werden wir unser Konzept von einem ausschließlich erkennungsbasierten Ansatz zu einem chemoselektiv fC vernetzungsbasierten Ansatz ausbauen. Dies werden wir ereichen, indem wir 1.) para-acetyl-L-phenylalanin (pAcF) kotranslational in geeignete TALE-Positionen durch genetische Kodierung in vivo einbauen, 2.) das modifizierte TALE an die fC-enthaltenden DNA-Zielpositionen binden lassen, und 3.) eine chemoselektive Vernetzung zwischen pAcF und fC durch katalytische Oximbildung mit einem bifunktionellen Aminooxy-Linker erzeugen, unter Bedingungen, die mit einer selektiven TALE-DNA-Komplexbildung kompatibel sind. Dadurch wird die Selektivität und Empfindlichkeit des Ansatzes deutlich erhöht und erstmals eine direkte und hochaufgelöste Quantifizierung von fC in Anwenderdefinierten genomischen Loci ermöglicht. Wir werden einen Festphasen-basierten Assay für die genomische Affinitätsanreicherung gekoppelt mit qPCR Quantifizierung entwickeln und dazu verwenden, die Kinetik der post-replikativen fC-Bildung im Mausgenom zu studieren.Dies wird erste Einblicke in die Dynamik von fC als Grundlage seiner biologischen Funktion ermöglichen und stellt einen Ausgangspunkt für Folgestudien dar, die zu einem besseren Verständnis der dynamischen Folgen der fC-Bildung hinsichtlich der weiteren Oxidation/Reparatur, als auch der Rekrutierung/Abstoßung von Reparatur- und epigenetischen Proteinen führen wird.
DFG-Verfahren
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