High resolution 3D-neuroanatomy of the retina - investigation of wiring rules in different contrast mechanisms
Systematik und Morphologie der Tiere
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Netzhaut der Wirbeltiere ist gleichermaßen ein Flächensensor und ein Bildverarbeitungsrechner. Die Umwelt wird auf ein Feld von Sehzellen abgebildet, die bereits auf einzelne Aspekte der Lichtumwelt wie z.B. unterschiedliche Wellenlängen (Farbkontrastsehen) oder Schwingungsrichtungen (Polarisationskontrastsehen) spezialisiert sind. Die Verschaltung der Sehzellen mit den nachgeschalteten Nervenzellen (Sekundärneuronen und Ganglienzellen) entscheidet dann, inwieweit und in welcher Qualität die Retina bereits Informationsvorverarbeitung treibt, bevor das die Umwelt repräsentierende elektrische Erregungsmuster an höhere Rechenzentren im Gehirn weitergegeben wird. Auf lichtmikroskopischem Niveau sind Zellmuster und Schichtungen zu erkennen, die eine regelhafte Verschaltung mehr als wahrscheinlich machen - auf elektronenmikroskopischem Niveau werden die Feinheit und das Ausmaß an Komplexität der „Verdrahtungen“ erkennbar. Die Untersuchung neuronaler Schaltkreise in der Retina ist u.a. mit den Problemen konfrontiert, dass die beteiligten Nervenzellen (1) sehr zahlreich sind, (2) sehr dünne und fein verzweigte Ausläufer bilden, (3) in unterschiedlichen Morphotypen vorliegen, für die es nur teilweise spezifische Markierungsmethoden gibt und (4) volumenfüllend miteinander „verfilzt“ sind. Mit den Methoden der 3D Elektronenmikroskopie wird es nun erstmals möglich alle Zellen einer Schaltkreiseinheit über ihre gesamte Ausdehnung, in der erforderlichen Auflösung und ohne spezifische Markierung zu erfassen und zu im Sinne ihrer Verschaltungsregeln analysieren. Gleichwohl ist der operative Aufwand für solche Untersuchungen groß und der Zugang zu geeigneten Geräten noch schwierig und z.T. sehr teuer. An der Sardellenretina, als Beispiel für eine Wirbeltier-Netzhaut im Allgemeinen und für eine auf Polarisationskontrastsehen getrimmte im Speziellen, haben wir Zugang und methodisches Vorgehen für verschiedene 3D-EM Methoden getestet, große Datensätze in derzeit bestmöglicher Qualität geschaffen und mit der Darstellung von Nervenzellen (für sich und im Verbund) und der Analyse ihrer Verschaltungsregeln begonnen. Im aktuellen Projekt wurden höchstauflösende (aber räumlich limitierte) Datensätze aus der besonders fein strukturierten äußeren plexiformen Schicht der Netzhaut gewonnen (basierend auf der Abtragung feinster Schichten mittels fokussiertem Ionenstrahl FIB und verzerrungsfreier Abbildung der neu geschaffenen Blockoberflächen) und mit größere Volumina abdeckenden Methoden kombiniert. Damit werden als Fortschritt gegenüber der ersten Projektphase nun auch Amakrin- und Ganglienzellen vollständig erfasst und Schaltkreise erstmals in ihrer vollen Ausdehnung analysierbar. Die Kombination von FIB mit konventionellen Ultradünnschnittserien und Abbildung am TEM ist möglich, aber aufgrund gravierender Bildverzerrungen mit einem großen Aufwand an digitaler elastischer Entzerrung verbunden. Dieser Weg wird für die Analyse ausgedehnter Volumina für ganze Nervennetze als weitgehend unpraktikabel bewertet. Die Kombination von FIB mit auf mechanischen Schnitten basierender Blockface-Rasterelektronenmikroskopie dagegen entpuppt sich als „die Lösung“ der Retina-Konnektomforschung schlechthin. Sind gute Präparationen gelungen und die Datensätze geschaffen und korrekt ausgerichtet, ist es relativ einfach Nervenzellen in 3D zu rekonstruieren, den Anschluss zwischen den Datensätzen herzustellen und Zellverbindungen ausfindig zu machen (teils durch „Kontakt“ benachbarter Zellen zueinander, teils sogar durch Identifikation synaptischer Feinstrukturen). Die Befunde aus der äußeren plexiformen Schicht zeigen (1) multiple direkte Verbindungen zwischen den Terminalen benachbarter Photorezeptoren, (2) rezeptorspezifische Kontakte von drei Horizontalzelltypen und (3) mehr oder weniger rezeptorspezifische Kontakte verschiedener Morphotypen von Biopolarzellen. In der inneren plexiformen Schicht zeichnen sich Verbindungen zwischen Bipolarzellen des gleichen Typs ab und eine Vielfalt von Kontakten zwischen Bipolaren, Amakrinen und Ganglienzellen. Bis zur „Abgabe“ eines vollständigen neuroanatomischen Bildes der (Sardellen)retina incl. ihrer Verschaltungregeln ist nach der Phase der Methodenentwicklung und Datenschaffung nun noch einiges an Auswertungsarbeit zu leisten – nunmehr allein eine Frage von Arbeitskraft und Zeit.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Disentangling retinal connectomics with 3D electron microscopy. 106th Annual Meeting of the German Zoological Society, 13 -16 September 2013, Munich, Germany
Heß M, Koch P, Scheungrab M, Wanner G
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3D fine structure and interconnections of cone pedicles in the European anchovy. 107th Annual Meeting of the German Zoological Society, 11 -14 September 2014, Göttingen, Germany
Scheungrab M, Guder P, Schulze K, Wanner G, Heß M
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Order in the chaos – unscrambling the interlaced fine structures of anchovy cone pedicles. 35th Göttingen Neurobiology Conference, 18 -21 March 2015, Göttingen, Germany
Scheungrab M, Schulze K, Wanner G, Heß M
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A retinal connectomics study using a combination of mechanical and FIB-based BFSEM. 109th Annual Meeting of the German Zoological Society, 14 -17 September, Kiel, Germany
Scheungrab M, Schulze K, Boergens K, Gour A, Helmstaedter M, Wanner G, Heß M
