Enzyme für die Biosynthese und den Einbau von Pyrrolysin, der 22. genetisch kodierten Aminosäure. Kristallstrukturen, Mechanismen und biotechnologische Anwendungen

• Antragsteller: Professor Dr. Michael Groll
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2015
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 226560260

Im Jahr 2002 wurde Pyrrolysin als 22. genetisch kodierte Aminosäure entdeckt. Im Speziellen ermöglicht die tRNA und die entsprechende Aminoacyl-tRNA Synthetase aus den Genen pylT und pylS ein Übersetzen des UAG-Stop-Codons. Der Einbau der ungewöhnlichen Aminosäure in Proteinsequenzen erfolgt im nächsten Schritt über die Proteinbiosynthese (Hao et al. 2002; Srinivasan et al. 2002). Obwohl bisher nur wenige Proteine identifiziert wurden, die Pyrrolysin im aktiven Zentrum aufweisen, nämlich Methylamin-Methyltransferasen, die im Methanstoffwechsel von methanogenen Archaeen der Familie Methanosarcinaceae eine entscheidende Rolle spielen, erweckt die Pyrrolysin-Biochemie größtes Interesse in der Forschung und wird bereits für den gezielten Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteinen zweckvoll genutzt. Kürzlich publizierte Studien zeigten, dass die Synthese von Pyrrolysin durch die drei aufeinanderfolgenden Proteine PylB, PylC und PylD erfolgt (Gaston et al. 2011). Der Mechanismus der Aminosäure-Biosynthese wurde bislang nur theoretisch aus verschiedenen voneinander unabhängigen Experimenten vorgeschlagen; keines der genannten drei Proteine konnte bislang strukturell und funktionell charakterisiert werden. Wir haben nun die Kristallstruktur des S-Adenosylmethionin-abhängigen Eisen-Schwefel-Cluster Proteins PylB gelöst (Quitterer et al., 2012) und verfolgen aufbauend auf dieser Arbeit das Ziel, den Mechanismus und die Regulation des PylB-Proteins näher zu untersuchen. Des Weiteren wird in diesem Forschungsvorhaben die Klonierung, die Expression sowie die Kristallstrukturanalyse von PylC und PylD angestrebt, um Einblicke in deren Reaktionsmechanismus zu erhalten. Zusätzlich sollen Pyrrolysin und hiervon abgeleitete Derivate sowohl durch Einsatz eines pylBCD-Operons als auch durch chemische Totalsynthese in großen Mengen hergestellt werden. Hierauf aufbauend ist die Etablierung eines modifizierten Expressions-Systems in E. coli geplant, das unter Verwendung der verschiedenen Pyrrolysin-Verbindungen und der Transformation eines Polynukleotidstranges mit einem in-frame UAG-Codons deren Einbau an einer definierten Position im Zielprotein ermöglicht. In diesen Versuchen ist unser Fokus primär auf die funktionelle und strukturelle Untersuchung von Proteinen mit einem Pyrrolysin / Pyrrolysin-Abkömmling im katalytisch aktiven Zentrum gerichtet.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen